基于生物信息學分析胃癌中MMP7表達及臨床意義

王繹博

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154002)

胃癌是全球范圍常見的惡性腫瘤之一，它是第四大最常診斷癌癥及第三大癌癥死亡病因〔1〕。研究表明，2018年全球新增胃癌病例多達100萬例，且有約78.3萬人死于該病〔2〕。胃癌的發病有明顯的性別和地域差異，表現為男性高于女性，東亞高于北美、北歐和非洲地區〔2〕。目前認為，幽門螺桿菌是胃癌的主要危險因素，有近90%的非賁門性胃癌與其相關〔3〕。此外，一些飲食和生活習慣，如食用腌制食物、低水果攝入、飲酒和吸煙也是明確的胃癌風險因素〔2〕。

基質金屬蛋白酶(MMPs)由前肽序列、催化結構域、鉸鏈區和血凝素(PEX)結構域組成〔4〕。研究表明，MMPs可通過消化細胞外基質(ECM)成分和刺激細胞表面蛋白，在ECM的重構中起至關重要的作用〔5〕。此外，MMPs還可以控制其他蛋白酶、生長因子、趨化因子和細胞受體活性，并調節許多生物學功能〔6〕。研究表明，腫瘤演進過程中的腫瘤生長、局部侵襲和轉移在很大程度上也依賴于MMPs的蛋白水解活性，它們通過降解ECM成分和釋放基質因子、細胞表面結合的細胞因子、生長因子等影響腫瘤免疫細胞招募和惡性轉化過程〔7〕。MMP7是MMPs家族中最小的酶類，其具有MMPs的共同特征，即降解酪蛋白、纖維連接蛋白、明膠和蛋白聚糖〔8〕。越來越多的證據表明，MMP7通過減少細胞黏附、抑制癌細胞凋亡和誘導血管生成，在腫瘤的發生發展中起關鍵作用〔9,10〕。此外，MMP7也被認為參與了腫瘤轉移、侵襲和炎癥級聯反應〔10,11〕。本研究利用生物信息學方法探討MMP7在胃癌中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1數據收集與預處理 從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫(https://cancergenome.nih.gov)下載胃癌和正常胃組織RNA-seq表達譜數據，并進行每百萬轉錄本(TPM)標準化，將TPM值作為樣本的表達值。另外，除了基因表達數據，還下載了每個患者的臨床參數，如年齡、性別、種族、生存狀態、腫瘤等級、腫瘤分期等。

1.2差異基因識別 利用UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/)計算每個基因在正常和腫瘤樣本中的平均TPM值，并進行兩組樣本間的差異統計，根據顯著性識別到了正常和腫瘤樣本之間的差異表達基因，最后保留前25個顯著高表達的基因并以熱圖形式展示。

1.3差異表達分析 利用UALCAN數據庫計算正常非癌組織與癌組織的MMP7基因表達水平。此外，利用臨床患者數據對原發腫瘤樣本進行分類，并生成不同亞組中每個基因的表達水平。

1.4生存分析 利用UALCAN數據庫用Kaplan-Meier(K-M)繪制生存率曲線。為了評估基因表達和臨床參數如患者種族、性別等的組合生存效果，采用多變量Kaplan-Meier生存分析。使用Log-rank檢驗計算組間差異的統計學顯著性。

1.5免疫浸潤分析 使用TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)確定MMP-7基因表達與相關基因、免疫浸潤的關系。根據6種類型的免疫浸潤細胞(包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突細胞)的豐度與MMP-7基因表達進行相關性分析。

1.6統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗和秩和檢驗，不符合正態分布的采用中位數和四分位數間距表示。Pearson相關性分析用于識別與MMP7基因顯著相關的基因。

2 結 果

2.1MMP7在胃癌組織中表達 胃癌組織中高表達基因的分布表明，MMP7為胃癌中第7位高表達基因(圖1)。與非癌組織〔2.462(0.120，9.138)〕比較，胃癌患者組織中MMP7表達水平〔29.558(7.698，101.378)〕顯著升高(P<0.01)。對患者年齡分析可見，41～60歲、61～80歲患者組織的MMP7表達水平顯著高于非癌組織(P<0.05)。此外，男性、女性、白種人及亞裔患者MMP7表達量均明顯高于非癌組(P<0.05)。見表1。

圖1 胃癌中25個顯著高表達基因熱圖

表1 非癌組及不同年齡、性別、種族胃癌患者MMP7表達

2.2MMP7與胃癌中高表達基因的相關性 胃癌中MMP7與前6位高表達基因中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CST)1、Ⅰ型膠原α1鏈(COL10A1)、MMP11、同源盒(HOX)A10、膠原三螺旋重復蛋白(CTHRC)1具有顯著相關性(r=0.164、0.144、0.194、-0.181、0.163；均P<0.05)，而與分泌型磷蛋白(SPP)1無相關性(r=0.053；P>0.05)。見圖2。

2.3不同臨床病理參數胃癌患者的MMP7表達情況 Grade 1、2、3級患者組織的MMP7表達水平均顯著高于非癌組，且Grade 3級顯著高于Grade 1級。此外，Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者組織的MMP7表達水平也均顯著高于非癌組(P<0.05)。與非癌組比較，有和無TP53突變患者組織的MMP7水平均顯著升高(P<0.001)。見表2。

圖2 MMP7與胃癌中高表達基因具有顯著相關性

2.4不同組織分型、幽門螺旋桿菌感染、淋巴結轉移胃癌患者的MMP7表達情況 與非癌組比較，非特異性腺癌、彌漫性腺癌、印戒細胞腺癌、非特異性腸型腺癌、腸型管狀腺癌、腸型乳頭狀腺癌的MMP7表達水平均顯著升高(P<0.05)，但腸型黏液腺癌與非癌組無顯著差異(P>0.05)。印戒細胞腺癌和腸型乳頭狀腺癌組的MMP7表達水平顯著低于非特異性腺癌和彌漫性腺癌組(P<0.05)。此外，有(或無)幽門螺旋桿菌感染、不同淋巴結轉移分期患者MMP7表達量均明顯高于非癌組(P<0.05)。見表3。

2.5MMP7表達上調與胃癌患免疫細胞浸潤相關性 免疫細胞浸潤評估顯示，MMP7高表達與胃癌中的CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞浸潤相關(r=0.183、0.112、0.228、0.186，均P<0.05)，而與B細胞和CD4+T細胞浸潤無關(r=-0.077、0.004，均P>0.05)。見圖3。

表2 不同臨床病理參數胃癌患者MMP7表達 情況

2.6MMP7表達上調可反映胃癌患者預后不良 生存分析顯示，高表達MMP7患者總體生存率顯著低于低/中表達組。多變量Kaplan-Meier生存分析顯示，MMP7高表達的男性患者和亞裔患者的預后最差。見圖4。

表3 不同組織分型、幽門螺旋桿菌感染、 淋巴結轉移胃癌患者的MMP7表達

圖3 MMP7表達上調與胃癌患免疫細胞浸潤具有相關性

圖4 MMP7表達上調可反映胃癌患者預后不良

3 討 論

正常和病理情況下ECM蛋白的水解及各種細胞表面分子的加工過程是由一大類依賴鋅的蛋白酶介導的，包括約24個MMPs，35個解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMs)和19個含Ⅰ型血小板結合蛋白基序解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)〔12〕。MMPs家族根據其結構域可被分為膠原酶、明膠酶、基質溶酶、母質溶酶和模型MMPs(MT-MMPs)〔13〕。MMPs可在生理和病理狀態下調節細胞的生長、遷移、存活和黏附。由于MMPs的關鍵作用，其表達水平的失調和激活可導致腫瘤細胞增殖、血管生成、生存、侵襲、惡性轉化和免疫失調〔14,15〕。腫瘤微環境(TME)是由實體腫瘤團塊內的細胞、ECM中的生化和生物物理成分相互作用形成的。在TME中含有大量的MMPs底物，包括天然的纖維膠原蛋白、變性的明膠及層粘連蛋白。MMPs可通過影響TME中 ECM的重構促進腫瘤細胞的進展和侵襲〔7〕。

MMP7也稱為基質溶解素，可調控多種病理生理過程，如傷口愈合、衰老、骨生長、炎癥和血管生成等〔9〕。MMP7上調已在多種人類癌癥類型中得到證實，這包括肺癌、黑色素瘤、食道癌、膽囊癌、胰腺癌、膀胱癌等。研究表明，下調MMP7可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔16〕。本研究結果顯示，在胃癌中高表達的前7位基因，均被證實可通過Wnt、轉化生長因子(TGF)β2/Smad/甲基轉移酶樣蛋白(METTL)3、缺氧誘導因子(HIF)-1α/趨化因子受體(CXCR)4等多條信號通路來促進胃癌進程〔17～21〕。本研究結果提示，MMP7可作為評估胃癌進程的生物標志物。Zhu等〔22〕在宮頸癌的研究中也證實了較高的MMP7表達與淋巴轉移、病理分級和臨床分期具有相關性。胃癌是一種高度異質性腫瘤，因此病理組織學分型的臨床實用性十分有限，Lauren根據組織結構和生物學行為提出的胃癌分型則被認為是最具預后價值的組織學分型〔23〕。本研究結果顯示，各型MMP7表達較正常組織均顯著上調。研究證實，在TME中，MMPs也可引導免疫細胞、成纖維細胞和間充質干細胞(間充質間質細胞)的過度募集，導致腫瘤組織的進一步混亂，最終促進腫瘤細胞的侵襲和擴散〔12〕。基于此，本實驗最后研究了MMP7與免疫細胞浸潤之間的關聯，結果提示MMP7參與了胃癌的免疫學進程和機制。

綜上，MMP7為胃癌中高表達基因，且其表達與其他促進胃癌進程的高表達基因具有顯著相關。此外，上調表達的MMP7還與胃癌患者臨床病理參數、預后不良、免疫細胞募集等具有相關性。