四味黃連洗劑對白色念珠菌和近平滑假絲酵母菌抑菌作用研究及有效成分篩選

朱紅，高家榮，魏良兵，單莉

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

白色念珠菌（Candida albicans）是真菌中的一種，為條件致病菌，主要存在于消化道、皮膚和泌尿生殖道黏膜[1]?？梢饻\表感染，但也可引起深度感染或危及生命的系統(tǒng)性感染[2]。近平滑假絲酵母菌（Candida parapsilosis）是一種可以引起侵襲性念珠菌病的真菌[3]，其感染的發(fā)病率在逐年升高，其主要存在于皮膚表面，而且很容易經(jīng)醫(yī)護(hù)人員的手在醫(yī)院中傳播。

四味黃連洗劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（三級甲等醫(yī)院）皮膚科多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，處方由黃連、黃柏、黃芩及大黃四味中藥組成，其組方合理、精煉，療效顯著，主治夏季蟲咬皮炎 、膿痱、膿皰瘡等。方中黃連清熱燥濕、瀉火解毒；黃柏、黃芩清熱燥濕；大黃瀉下攻積，清熱瀉火，利濕退黃[4]。

四味黃連洗劑在臨床應(yīng)用中，對皮膚真菌感染存在較好療效。為探究其藥效成分及作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選擇白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌兩種致病真菌，采用微生物試紙擴(kuò)散法（K-B法）藥敏實(shí)驗(yàn)體外測定四味黃連洗劑對兩種真菌代謝活性的影響，探討四味黃連洗劑的有效單味藥材并進(jìn)行缺味驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；CLSI法測定優(yōu)化后的四味黃連洗劑的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值；CLSI和Spot assay法測定鹽酸小檗堿的最低MIC值及對近平滑假絲酵母菌細(xì)胞活性的影響，為四味黃連洗劑臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料

1 菌株

白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌（由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室分離，張昌峰副主任檢驗(yàn)師鑒定）。

2 藥物

空白藥敏紙（實(shí)驗(yàn)室自制，紫外燈光下照射1h）；氟康唑藥敏紙（批號：K1004，ROSCO）；苯甲酸鈉（批號：C02201804002，武漢有機(jī)實(shí)業(yè)有限公司）；羥苯乙酯（批號：103620170101，湖南爾康制藥股份有限公司）；黃連（批號：202100326）、黃芩（批號：20210410）、黃柏（批號：20210117）、大黃（20190402），安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)中藥房韓光磊主任藥師鑒定符合《中國藥典》2020年版一部規(guī)定。鹽酸小檗堿（批號：110713-201814，中國食品藥品檢定研究院）。

實(shí)驗(yàn)儀器

微生物分析鑒定儀（型號：VITEKZcomPACT，法國梅里埃）；麥?zhǔn)媳葷峁軆x（Densichek plus）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號：GNP-9160，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫電熱套（型號：SKM型，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（型號：BP211D，德國SARTORIUS公司）；MH瓊脂培養(yǎng)基（批號：190321，江門市凱林貿(mào)易有限公司）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：3102267，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；高壓滅菌鍋（型號：YXQ-LS-75G，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；冰箱（型號：SC-609，澳柯瑪股份有限公司）。

制備方法

1 四味黃連洗劑藥敏紙的制備

取四味黃連洗劑10μl，在無菌環(huán)境下滴于置紫外線線照射1h后的空白藥敏紙上，即得。

2 不同濃度單味藥材溶液藥敏紙的制備

按處方比例及制備工藝制備1：1的黃芩、大黃、黃連、黃柏提取溶液各100mL，分別取10mL濃縮至5mL得2：1比例的各供試品溶液；高壓蒸汽滅菌后，取各溶液各10μL制成含藥藥敏紙。

3 缺味組方供試品溶液藥敏紙的制備

按處方比例及制備工藝，分別制成缺大黃的供試品溶液、缺黃芩的供試品溶液、缺大黃和黃芩的供試品溶液，取各溶液各10μL制成含藥藥敏紙。

4 制劑輔料溶液藥敏紙的制備

按處方比例分別稱取羥苯乙酯和苯甲酸鈉適量，加入適量水，高壓蒸汽滅菌，各取10μL制成含藥藥敏紙。

5 陽性對照藥敏紙

以氟康唑藥敏紙為陽性對照。

6 空白對照藥敏紙

取紫外燈光下照射1h后的濾紙圓片為空白對照藥敏紙。

7 白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌菌液濃度

取臨床實(shí)驗(yàn)白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌菌株，用麥?zhǔn)媳葷峁軆x調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?，備用?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1 四味黃連洗劑對白念珠菌絲、近平滑假絲酵母菌代謝影響[8-10]

采用微生物試紙擴(kuò)散法（K-B法）觀察四味黃連洗劑對白念珠菌絲、近平滑假絲酵母菌代謝影響。取三組藥敏紙實(shí)驗(yàn)于分別涂布有白色念珠菌及近平滑假絲酵母菌瓊脂的培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察菌株生長情況。

從圖1我們可以看出，1、2藥敏紙無抑菌圈出現(xiàn)，3藥敏紙抑菌圈不明顯，可見四味黃連洗劑體外對白色念珠菌抑菌效果較差；圖2中1、2藥敏紙抑菌圈明顯，比3藥敏紙的抑菌圈大；4藥敏紙無抑菌圈，氟康唑?qū)φ战M亦出現(xiàn)明顯抑菌圈，可見在體外情況下四味黃連洗劑與氟康唑?qū)交俳z酵母菌有抑制作用。

圖1 白色念珠菌K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)

圖2 近平滑假絲酵母菌K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)

2 輔料抑菌作用

四味黃連洗劑中有羥苯乙酯、苯甲酸鈉兩種輔料添加劑，現(xiàn)對羥苯乙酯、苯甲酸鈉抑菌作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)如下：

在圖3中，對這兩種添加劑進(jìn)行了抑菌效果的排除，1、2藥敏紙均無抑菌圈出現(xiàn)，無抑菌作用，對四味黃連洗劑的抑菌效果無干擾。由此可知，四味黃連洗劑中的黃連、黃柏在原組濃度下體外有明顯的抑制近平滑假絲酵母菌作用

圖3 K-B法羥苯乙酯、苯甲酸鈉體外抑菌實(shí)驗(yàn)

3 四味黃連洗劑中各藥味對近平滑假絲酵母菌的體外抑菌作用

取各組藥敏紙分別涂布有近平滑假絲酵母菌瓊脂的培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察菌株生長情況。從圖4可以看出2、3藥敏紙抑菌圈明顯，5藥敏紙抑菌圈明顯，但<2、3藥敏紙，說明在同一濃度下，黃連、黃柏的體外抑菌效果較復(fù)方更好；4藥敏紙無抑菌圈出現(xiàn)；1藥敏紙先抑菌后菌落回漲顯現(xiàn)，體外抑菌效果有限；由此可見，在四味黃連洗劑中，黃連、黃柏藥味對體外近平滑假絲酵母菌有抑菌作用，為本制劑的有效抑菌藥味。

圖4 K-B法1：1濃度下各單味藥材抑菌實(shí)驗(yàn)

由圖5可知，3、4藥敏紙抑菌作用增加，抑菌圈更明顯；2藥敏紙抑菌圈更明顯；1、5藥敏紙無抑菌作用，可見大黃、黃芩在1：1、2：1濃度下對體外近平滑假絲酵母菌均無抑菌效果。

圖5 K-B法2倍濃度下各藥味的抑菌實(shí)驗(yàn)

4 缺味四味黃連洗劑對近平滑假絲酵母菌菌落生長的影響

取各組藥敏紙實(shí)驗(yàn)于分別涂布有近平滑假絲酵母菌瓊脂的培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察菌株生長情況，如圖6，在“4.2”中，我們確定了大黃、黃芩對近平滑家絲酵母菌無體外抑菌作用，故此次進(jìn)行缺味實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處方優(yōu)化。由圖6可知，①藥敏紙抑菌圈出現(xiàn)，但抑菌圈較小，抑菌效果有限。由此可見，缺少大黃的復(fù)方溶液抑菌效果下降，大黃雖無直接抑菌作用，但在復(fù)方中可能起重要的“佐”方作用；②藥敏紙無抑菌圈出現(xiàn)，可見黃芩、黃柏與大黃三者的混合溶液有很好的抑菌作用；③藥敏紙抑菌圈明顯，抑菌作用較好，可見黃連、黃柏的混合溶液有較好的抑菌效果，應(yīng)為本方的“君”藥。

圖6 缺味四味黃連洗劑對近平滑假絲酵母菌的抑菌試驗(yàn)

5 四味黃連洗劑的最低抑菌濃度

取0.5麥?zhǔn)系慕交俳z酵母菌菌液1000μL，加374mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，震蕩混勻濃度即為4*106，取混勻后的菌液1000μL，再加入999mL沙氏葡萄糖稀釋為2*103。

取四味黃連洗劑，旋蒸成干粉，取1024μg溶于1mL蒸餾水中，按二倍稀釋法稀釋為512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL，取各濃度下溶液100μL，加入菌液100μL；在陽性對照管中加入100μL菌液；在空白對照管中加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液100μL。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

由 圖7 可 知，16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml試 管內(nèi)發(fā)生混濁，有細(xì)菌生長，而 128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml試管內(nèi)澄清透明，無細(xì)菌生長，所以四味黃連洗劑對近平滑假絲酵母菌的最低抑菌濃度為128μg/ml。由圖可見，其MIC值較高，抑菌效果不理想，故繼續(xù)探究其有效抑菌成分。由于在黃連和黃柏兩味藥材中，其主要成分為鹽酸小檗堿，故選擇鹽酸小檗堿進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖7 最低抑菌濃度（MIC）的測定

6 Spot assay 檢測對鹽酸小檗堿近平滑假絲酵母菌細(xì)胞活性影響[7-9]

取0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊慕交俳z酵母菌細(xì)胞溶液，用 RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋菌液至 4×103CFU/mL 備用。精密稱取鹽酸小檗堿4.096mg溶于10uL DMSO中，加入RPMI 1640培養(yǎng)基4mL，配制成質(zhì)量濃度為1024μg/mL 的原液，倍比稀釋質(zhì)量濃度為512μg/mL、256 μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL，分別與同體積不同濃度的菌液混勻，菌液濃 度 分 別 為 2×105CFU/mL、2×104CFU/mL、2×103CFU/mL、2×102CFU/mL、2×101CFU/mL，各 取 5μL點(diǎn)種于固體沙氏培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，結(jié)果見圖8。

圖8 Spot assay 檢測對鹽酸小檗堿對近平滑假絲酵母菌細(xì)胞活性影響

從spot assay來看，近平滑假絲酵母菌落數(shù)（CFU/mL）隨著鹽酸小檗堿濃度的升高而逐漸減少，鹽酸小檗堿可顯著抑制近平滑假絲酵母菌活性，由此可見鹽酸小檗堿為四味黃連洗劑的治療抑制近平滑假絲酵母菌有效抑菌成分。

討 論

1 本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)四味黃連洗劑對白色念珠菌無抑菌效果

氟康唑?qū)Π咨钪榫囊志Ч嘤邢蓿赡苁且驗(yàn)閷?shí)驗(yàn)用白色念珠菌為臨床菌株，存在一定的耐藥性，后面實(shí)驗(yàn)將采用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)一步驗(yàn)證四味黃連洗劑的抑菌性。

2 本實(shí)驗(yàn)研究表明鹽酸小檗堿為四味黃連洗劑的治療抑制近平滑假絲酵母菌有效抑菌成分

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)研究，黃筱雪[5]研究鹽酸小檗堿對19 種植物病原真菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿具有廣譜抑菌作用，其質(zhì)量濃度的變化對抑制效果的影響較明顯。郭欣瑩等[6]研究表明氟康唑治療肺部真菌感染的臨床效果，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

3 近平滑假絲酵母菌近年來成為真菌致病的第二大菌種

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四味黃連洗劑和鹽酸小檗堿對其有抑菌作用，鹽酸小檗堿的MIC值更低。中藥復(fù)方藥味多，成分復(fù)雜，成分間存在協(xié)同或者拮抗作用的可能性，在以后的研究中將進(jìn)一步探索四味黃連洗劑中多成分間的關(guān)系，提高四味黃連洗劑的藥效，發(fā)揮中藥復(fù)方制劑的優(yōu)勢，為臨床服務(wù)。