骨痹通消顆粒治療激素性股骨頭壞死的分子機制*

侯文淵，朱彩玉，朱磊，顧一帆，周正新

1 安徽中醫(yī)藥大學 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

激素性股骨頭壞死（Steroid induced necrosis of femoral head，SANFH）是股骨頭的多種組織成分如骨髓造血細胞、骨組織和脂肪細胞等活性組織在高劑量激素刺激下而死亡的病理過程[1]。據(jù)報道，有55.75%的女性和26.35%的男性股骨頭壞死是糖皮質(zhì)激素所導致[2]。由于SANFH的發(fā)病年齡往往青年化且難以治愈，因此已經(jīng)成為年輕人髖關(guān)節(jié)殘疾最常見的原因之一[3]。

骨痹通消顆粒是全國名中醫(yī)丁鍔教授在骨蝕寧方的基礎(chǔ)上，倡導補腎活血通絡(luò)大法化裁而來。骨痹通消顆粒（丹參 15g，川芎 10g，當歸 10g，赤芍 12g，淫羊藿 10g，續(xù)斷 10g，肉桂 4g，土鱉蟲 6g，甘草 6g）由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制成顆粒劑，其最主要的藥理作用是補腎、活血、通絡(luò)。已有研究表明，應(yīng)用該復方治療股骨頭壞死在臨床上效果顯著[4]。動物試驗數(shù)據(jù)表明，骨痹通消顆粒可能有助于改善類固醇誘導的股骨頭壞死的進展[5]。然而，其關(guān)鍵活性化合物、潛在靶點以及作用途徑尚不清楚。

近年來，系統(tǒng)藥理學的一般解決方案被提出，研究多靶點化合物影響中藥生物網(wǎng)絡(luò)的多種分子機制已成為當前研究的熱點。因此，本研究采用系統(tǒng)藥理學的方法，結(jié)合分子對接和分子動力學模擬等手段探討中藥復方骨痹通消顆粒對SANFH的藥理作用機制。

資料與方法

1 復方成分和靶點的篩選

復方骨痹通消顆粒由丹參、川芎、當歸、赤芍、淫羊藿、續(xù)斷、肉桂、土鱉蟲和甘草9味中藥組成，我們在 TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmsp-e.com/）以及 SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上以口服生物利用度（OB ≥ 30%）和類藥性（DL ≥ 0.18）作為篩選條件，對骨痹通消顆粒的9味中藥進行化學成分及其作用靶點的篩選。

然 后，我 們 使 用 UniProt數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org）將這些藥物靶點的蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因Symbol。值得注意的是，TCMSP數(shù)據(jù)庫未涵蓋中藥土鱉蟲，因此，我們通過大量查閱文獻收集到土鱉蟲化學成分及預測成分作用的所有靶點。

2 疾病靶點的篩選

我們使用 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.omim.org）和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/），以疾病英文縮寫“SANFH”作為關(guān)鍵詞進行檢索，得到相關(guān)疾病靶點。然后將上述三種數(shù)據(jù)庫中獲得的疾病靶點進行Excel列表匯總，確定SANFH的相關(guān)靶點，然后將整理所得復方的靶點和藥物的靶點取交集。

3 復方藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CytoScape 3.8.0軟件被用來構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。為了闡明骨痹通消顆粒靶點與SANFH疾病靶點間的作用關(guān)系，我們利用R 4.1.1軟件計算兩者的交集靶點，然后使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cyto-Scape軟件確對網(wǎng)絡(luò)的拓撲形態(tài)進行進一步分析。

4 基因富集分析

繼上一步分析的結(jié)果，使用Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/gp/index.html）進 行 GO（生 物過程）分析，根據(jù)Q值，對排名前20的生物學過程使用R軟件繪制氣泡圖，并對排名前20的KEGG通路進行可視化分析，篩選出可以用于解釋骨痹通消顆粒治療SANFH的通路。

5 成分-靶點分子對接驗證

分子對接開始之前，我們將分析得到的靶點和成分一一對應(yīng)，然后置于PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取骨痹通消顆粒關(guān)鍵活性成分的Smiles格式，使用Chem3D 19.0軟件獲得對應(yīng)的小分子pdb文件，使用PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點的PDB 文件。使用 DS（Discovery Studio 4.5 Client）蛋白大分子處理軟件處理，最后由 AutoDock Tools Vina 1.1.2軟件進行分子對接，得到對接的結(jié)合能以及相應(yīng)的配體-受體結(jié)合的3D圖。

6 分子動力學模擬

分子動力學模擬（Molecular Dynamics Simulation，MD）主要是依靠牛頓力學模擬配體在蛋白體系的運動情況，在配體運動進行每個步驟的同時，抽取狀態(tài)樣本數(shù)據(jù)進行體系的構(gòu)型分數(shù)計算，并根據(jù)計算結(jié)果進行諸如均方根誤差（RMSD）和均方根浮動（RMSF）的呈現(xiàn)。進行分子對接后，盡管有很多體系的結(jié)合效果很好（結(jié)合能高），但是我們并不知道當施加人體環(huán)境作用后，該體系是否依然穩(wěn)定。

進行MD模擬的方法有很多，但最有效且公認的方法是通過GROMACS進行的，因此，我們的MD模擬也是基于GROMACS程序包的，在MD模擬開始之前，我們預先設(shè)置了一系列參數(shù)進行體系的平衡，比如使用水分子的TIP3P模型，溶劑環(huán)境為中性氯化鈉溶液，溫度為開爾文溫度310K（約為人體的36.85℃），在1個標準大氣壓下開始MD模擬。

最后，我們使用Origin 2018軟件對RMSD結(jié)果進行可視化，得到了RMSD（nm）隨時間（ns）變化的三體系折線圖。

結(jié) 果

1 藥物成分與靶點篩選

我們借助TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索骨痹通消顆粒中9味中藥的成分，共檢索到有效成分丹參65個，川芎7個，當歸2個，赤芍29個，淫羊藿23個，續(xù)斷8個，肉桂65個，土鱉蟲18個以及甘草92個。部分有效成分見表1。

表1 骨痹通消顆粒部分化合物成分

然后我們借助SwissTargetPrediction、TCMSP和Perl語言預測到丹參的有效成分靶點932個，川芎的有效成分靶點42個，當歸的有效成分靶點69個，赤芍的有效成分靶點158個，淫羊藿的有效成分靶點511個，續(xù)斷的有效成分靶點63個，肉桂的有效成分靶點166個，土鱉蟲的有效成分靶點1445個以及甘草的有效成分靶點1769個，將這9味中藥的作用靶點合并后去重共得到靶點678個。

2 成分靶點與疾病靶點交集

借助GeneCards、OMIM和PharmGkb三個疾病靶點數(shù)據(jù)庫得到SANFH相關(guān)的所有靶點，分別得到1367個，120個和380個結(jié)果。我們使用R 軟件將SANFH疾病靶點及所有藥物成分靶點進行篩選篩選，去除重復的靶點后，使用R 軟件將成分靶點和疾病靶點取交集，同時繪制出交集的Venn圖（見圖1），得到SANFH靶點共1644個，其中，所有中藥有效成分靶點共678個，SANFH和中藥有效成分的交集靶點共283個。

圖1 SANFH靶點和藥物靶點的交集

3 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

我們將篩選到的中藥成分和成分-疾病交集靶點借助R軟件和Cytoscape軟件繪制中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。骨痹通消顆粒治療SANFH相關(guān)的中藥有效成分共199個（其中關(guān)于土鱉蟲的有效成分17個，當歸2個，續(xù)斷4個，肉桂14個，淫羊藿16個，川芎6個，丹參58個，甘草88個，赤芍12個）。對應(yīng)交集靶點數(shù)目排名前十的有效成分及其來源：槲皮素（甘草）、十六碳烯酸（肉桂，土鱉蟲）、肉豆蔻酸（土鱉蟲）、棕櫚酸（土鱉蟲）、十六碳-9，12-二烯酸（土鱉蟲）、4'，5-二羥基 -7-甲氧基黃酮（土鱉蟲）、月桂酸（土鱉蟲）、鯊甘醇（土鱉蟲）、十四碳烯酸（土鱉蟲）、山萮酸（土鱉蟲）；其中最多者槲皮素對應(yīng)96個靶點，最少者山崳酸對應(yīng)43個靶點。推測骨痹通消顆粒主要通過以上有效成分來發(fā)揮SANFH的治療作用，應(yīng)予以重視和進一步研究。

圖2 骨痹通消顆粒治療SANFH的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

在中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中，綠色結(jié)點代表藥物，藍色結(jié)點代表活性成分，其中紫色結(jié)點代表共同活性成分，紅色結(jié)點代表靶點，中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中共匯集了4229條邊，888個結(jié)點。

4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

為了闡明靶點蛋白間的相互作用，將交集的283個靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，物種選擇Homo sapiens，相互作用結(jié)合分數(shù)≥ 0.7，去除游離無連接的節(jié)點，構(gòu)建蛋白互質(zhì)（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型（見圖3），網(wǎng)絡(luò)共有268個節(jié)點，2141個邊，其中，結(jié)點為靶點，連線為靶點之間存在互作關(guān)系，結(jié)點的顏色、大小以PPI得分繪制，結(jié)點越大且結(jié)點顏色越深表示兩靶點在該網(wǎng)絡(luò)越重要。節(jié)點度值最大81，中位數(shù)41以上的16個靶點視作核心靶點，并構(gòu)建核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖4），圖中結(jié)點代表核心靶點，連線代表核心靶點之間存在互作關(guān)系，顏色與度值呈正相關(guān)，顏色越深表示靶點在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。

圖3 骨痹通消顆粒-SANFH靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

我們繼續(xù)使用CytoScape自帶的MCODE分析PPI網(wǎng)絡(luò)，確定潛在蛋白質(zhì)相互作用拓撲網(wǎng)絡(luò)。MCODE分析發(fā)現(xiàn)，共11個拓撲網(wǎng)絡(luò)，每個拓撲結(jié)構(gòu)中的蛋白有著更為緊密的聯(lián)系，作score得分前5個拓撲模塊的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖5）。

圖5 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中的拓撲子網(wǎng)絡(luò)

5 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果

為了使富集結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，我們將P<0.05作為GO富集分析（生物過程）和KEGG通路分析的條件，并將P值排在前20的條目通過R軟件繪制出氣泡圖。其中，GO生物過程富集分析得到607個條目（見圖6a），對應(yīng)靶點60個，KEGG通路分析得到162條信號通路（見圖6b），對應(yīng)靶點49個。

圖6 （A）GO富集分析（生物過程）（B）KEGG富集分析

可見，骨痹通消顆粒是通過參與多種生物過程和多種通路來發(fā)揮作用的。通過比較富集分析的靶點排名以及分布情況，綜合考慮TP53、AKT1、SRC、STAT3、MAPK3、JUN、MAPK1、EGFR、IL6、ESR1、MYC、RELA、CASP3、VEGFA、IL1B 和 RXRA 等 16個以上的靶點具有較為重要的作用。

6 成分-靶點分子對接驗證分析結(jié)果

本研究選取骨痹通消顆粒活性成分中Degree值排名前3的關(guān)鍵藥效物質(zhì)槲皮素、肉豆蔻酸及棕櫚油酸（Quercetin、Myristic acid 和 Palmitoleic acid），分別與核心靶點TP53、AKT1和SRC進行分子對接，結(jié)合能結(jié)果見表2。

表2 分子對接詳細結(jié)果

使用PyMol軟件將對接結(jié)果進行可視化（見圖7），從圖中我們可知，Quercetin與AKT1靶點的氨基酸殘基 ASN-54、GLN-79、LEU-210和 SER-205形成氫鍵，與TP53靶點的氨基酸殘基ALA-138、ARG-196、SER-166、ASP-186和 ASN-200形成氫鍵，與SRC靶點的氨基酸殘基LYS-298、THR-341、ASP-407、GLU-342 和 MET-344 形成氫鍵；Myristic acid 與AKT1靶點的氨基酸殘基VAL-271、ASN-54和GLN-79形成氫鍵，與TP53靶點的氨基酸殘基SER-166和ARG-196形成氫鍵，與SRC靶點的氨基酸殘基GLY-279形成氫鍵；Palmitoleic acid與 AKT1靶點的氨基酸殘基THR-82、THR-81和ASP-292形成氫鍵，與TP53靶點的氨基酸殘基ARG-196和ASN-235形成氫鍵，與SRC靶點的氨基酸殘基LYS-298形成氫鍵。對接結(jié)果表明，當骨痹通消顆粒中的三種關(guān)鍵成分結(jié)合于SANFH的靶點上時，SANFH的靶點表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。

圖7 關(guān)鍵藥效物質(zhì)-核心靶點分子對接

7 分子動力學模擬結(jié)果

顯而易見，我們根據(jù)分子對接的結(jié)果可以看到槲皮 素 與 TP53（-8 kcal/mol）、AKT1（-9.6 kcal/mol）和SRC（-10.1 kcal/mol）三個靶點有著較好的結(jié)合能效果，然而，MD模擬的結(jié)果并沒有像預想的一樣與分子對接結(jié)果對應(yīng)（見圖8），可見MD模擬的重要性。

圖8 三個體系的MD模擬結(jié)果（RMSD）

MD模擬結(jié)果顯示，分子對接結(jié)合能最高的SRC靶點在人體中卻沒有特別穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但是該體系的RMSD波動較為微小，有一定的研究價值。相反，槲皮素與AKT1無論是在結(jié)合能上還是在RMSD中，都表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象，而槲皮素與TP53的RMSD結(jié)果表現(xiàn)得更加糟糕，甚至不值得進行下一步研究。

討 論

自從Pietrogrande1953年首次報道股骨頭壞死與激素相關(guān)以來[6]，SANFH引起了越來越多的學者的關(guān)注。目前，盡管提出了許多發(fā)病機制假說，如脂質(zhì)代謝紊亂、骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化、血管內(nèi)凝血、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等[7-8]，但針對SANFH具體的發(fā)病機制仍然沒有統(tǒng)一的結(jié)論。

股骨頭壞死在中醫(yī)歸為“骨痹”“骨蝕”“骨痿”范疇，如《素問·長刺節(jié)論篇》指出“骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名骨痹”[9]。許多醫(yī)家認為，骨痹以肝腎虧虛為主要病因，氣滯血瘀是其病理基礎(chǔ)，治宜補益肝腎，活血化瘀[10-12]。周正新教授以補腎活血為原則，在臨床上使用骨痹通消顆粒治療股骨頭壞死效果明顯，但由于中藥成分的復雜性和疾病發(fā)病機制的多樣性，骨痹通顆粒治療股骨頭壞死的藥理機制的探索仍處于初期階段，極大地限制了其臨床應(yīng)用和發(fā)展。

通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選出網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中Degree排名前3的藥物活性成分，分別為槲皮素、肉豆蔻酸及棕櫚油酸。其中，槲皮素是方中淫羊藿、甘草的主要活性成分。研究表明，槲皮素不僅可以通過miRNA-206/Cx43通路刺激骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，促進成骨細胞增殖，防止骨質(zhì)丟失[13]。還可以通過抑制IRAK1/NLRP3信號通路，下調(diào)IRAK1、NLRP3和caspase-3的表達水平，抑制炎癥和凋亡，減輕關(guān)節(jié)軟骨的退化和侵蝕[14]。此外槲皮素還可通過p-38α/β信號通路抑制巨噬細胞極化并調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡，減輕全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體磨損顆粒導致的炎癥反應(yīng)[15]。肉豆蔻酸和棕櫚油酸是土鱉蟲的主要活性成分。研究證明，膳食脂肪酸可以調(diào)節(jié)代謝和免疫反應(yīng)，提高全身胰島素敏感性，刺激β細胞分泌胰島素，增加肝臟脂肪酸氧化，改善血脂水平，并改變巨噬細胞的分化[16]。另外在LDLR-KO（低密度脂蛋白受體缺陷）小鼠中，添加棕櫚油酸可降低動脈粥樣硬化的發(fā)展，并與改善脂質(zhì)和糖代謝以及參與脂肪生成和炎癥的調(diào)節(jié)基因有關(guān)，表明棕櫚油酸在代謝紊亂方面的具有潛在作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻酸通過抑制RAGE、Keap1的上調(diào)和Nrf2、NQO1、HO1、SOD、CAT和GPx的下調(diào)，使細胞免受氧化應(yīng)激。還可以通過降低炎癥（NF-κB，p65，IKKβ，TNF-α，IL-1β 和 iNOS）和凋亡（Bax和 caspase-9），升高抗凋亡（Bcl-2）標志物水平來阻止炎癥和凋亡的增加[18]。通過上述結(jié)果，課題組認為，骨痹通消顆粒主要通過君藥淫羊藿、土鱉蟲中有效活性成分如槲皮素、肉豆蔻酸等，來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制炎癥的反應(yīng)，阻止細胞凋亡，從而延緩SANFH的發(fā)生發(fā)展。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)AKT1、SRC和TP53為治療SANFH的核心蛋白。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為AKT激酶（AKT1、AKT2和AKT3）[19]。AKT1具有調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、凋亡以及血管生成、血液流速、組織重塑的能力，已被提出作為促進血管生成相關(guān)的治療靶點，在股骨頭缺血性壞死中治療中發(fā)揮著重要的作用[20]。SRC是一種酪氨酸蛋白激酶，在細胞生長、分裂、遷移和生存信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。TP53蛋白是一種抑制異常細胞生長的腫瘤抑制因子，功能性TP53被認為可以感知DNA損傷，隨后誘導異常細胞的DNA修復、生長阻滯或凋亡[22]。同時TP53和Parkin共同調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞中的線粒體吞噬，可以促進早期激素誘導的ONFH的修復[23]。

GO功能富集分析結(jié)果表明，骨痹通消顆粒治療SANFH的283個潛在靶點的主要生物學過程涉及激素代謝過程、生物對脂多糖、細菌源分子、藥物、氧化應(yīng)激的應(yīng)答過程。KEGG通路富集結(jié)果表明，核心靶點對應(yīng)的顯著信號通路主要包括脂質(zhì)代謝紊亂、AGE-RAGE通路、白細胞介素17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、內(nèi)分泌抵抗通路。這些通路主要與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、血管生成、骨代謝及免疫調(diào)節(jié)等有關(guān)，且相互之間有著協(xié)同效應(yīng)，其中脂質(zhì)代謝通路擁有最低的P-value和最多的富集基因數(shù)。由激素誘導的脂質(zhì)代謝紊亂引起的股骨頭壞死主要有兩種機制：微血管脂肪栓塞和骨細胞脂肪沉積[24]。相關(guān)研究表明由于使用激素，皮下脂肪動員增加。隨著給藥時間的延長，血脂水平呈增加的趨勢，進而導致脂質(zhì)分布異常，微血管內(nèi)脂肪栓塞，髓腔內(nèi)脂肪堆積，脂肪細胞體積增大，髓腔內(nèi)壓力升高[25]?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實脂質(zhì)代謝紊亂是激素性股骨頭壞死發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)[26]。因此，課題組推測骨痹通消顆粒主要通過調(diào)控糖皮質(zhì)激素引起的脂質(zhì)代謝紊亂，減輕股骨頭內(nèi)微小動脈的脂肪沉積和脂肪栓塞，降低骨內(nèi)壓，促進血流通暢，來達到防治SANFH的目的。

分子對接結(jié)果顯示，骨痹通消顆粒中關(guān)鍵藥效物質(zhì)槲皮素、肉豆蔻酸及棕櫚油酸與核心靶點蛋白AKT1、SRC及TP53能夠穩(wěn)定地結(jié)合，表明骨痹通消顆粒可能作用于上述靶點，從而治療SANFH。而MD模擬驗證結(jié)果表明，槲皮素與AKT1的復合物體系能夠穩(wěn)定存在于人體，并且不會產(chǎn)生其他不良影響，因此槲皮素與AKT1的結(jié)合可成為治療SANFH的新思路。

綜上所述，本研究以骨痹通消顆粒和SANFH為探討對象，以系統(tǒng)藥理學為基礎(chǔ)，結(jié)合SANFH的病理機制，排除缺乏特異性的信號通路，我們推測骨痹通消顆粒通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激等信號通路發(fā)揮補腎、活血、通絡(luò)的功效，這可能是其治療SANFH的作用機制之一。為后續(xù)的研究提供了理論支撐，為臨床用藥及靶向新藥研發(fā)提供了導向支持。