西黃丸治療原發(fā)性肝癌的活性成分及作用機制*

龍雪晴，陳威，童汪霞

1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院 廣西南寧 530001

2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530000

肝細胞癌（Hepato Cellular Carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的90%以上[1]。原發(fā)性肝癌是一個重大的國際健康問題。全球肝癌發(fā)病率一直在上升，2012年新發(fā)病例增至782，000例[2]。根據巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinical Liver Cancer，BCLC）分 期系統(tǒng)，肝癌的治療應利用腫瘤負荷、潛在的肝功能和表現狀態(tài)來對患者進行分層，以選擇適當的治療方案。但總的發(fā)展趨勢正朝著治療方案的整合發(fā)展。多作用、多靶點的治療將顯示出比任何單一手術或靶點藥物更好的療效。

中醫(yī)將原發(fā)性肝癌以“肝積”稱之，中藥活性成分通過多種機制發(fā)揮抗肝癌作用，包括調節(jié)腫瘤組織微環(huán)境，抑制腫瘤干細胞增殖，抑制腫瘤血管形成，促腫瘤細胞凋亡、抑制其轉移，還通過免疫炎癥調節(jié)殺滅腫瘤細胞[3-4]。西黃丸處方來源于《外科證治全生集》，是清代名醫(yī)王洪緒的祖?zhèn)髅胤?，由牛黃（NH）15g，麝香（SX）15g，乳香（RX）550g，沒藥（MY）550g制成[5]。全方以清熱解毒與豁痰散結為主，活血祛瘀藥為輔，多用于治療癰疽疔毒、瘰疬、流注、癌腫等。現代藥理研究表明，西黃丸中的活性成分可通過多個靶點干預腫瘤細胞的代謝、轉運或吸收，從而抑制腫瘤生長、侵襲和轉移。西黃丸中的幾種成分，如麝香酮、β-乳香酸及沒藥甾酮，通過抑制腫瘤新生血管生成，抑制腫瘤細胞DNA的合成以及抑制抗凋亡基因等機制而顯示出治療腫瘤的活性[6-7]。然而，西黃丸的綜合成分及其多重作用，以及抗肝癌的潛在機制還沒有得到很好地闡明。

網絡藥理學是一種新興的方法，這一方法已經成功地用于闡明中醫(yī)藥在幾種疾病中的多靶點效應[8-10]。網絡藥理學有效地彌合了西醫(yī)和傳統(tǒng)醫(yī)學之間的鴻溝，極大地促進了對中藥協(xié)同作用的機械性研究[11]。本研究旨在運用系統(tǒng)網絡藥理學分析方法，鑒定中藥復方西黃丸治療原發(fā)性肝癌的活性成分及其作用機制。

材料與方法

1 西黃丸活性成分的提取與篩選

西黃丸中牛黃、乳香、沒藥的化學成分均來自中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數據庫分析平臺TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）。分別以牛黃、乳香、沒藥為關鍵檢索詞，在TCMSP數據庫中獲得了西黃丸中3味藥物的有效活性成分，并通過口服生物利用度（OB），藥物相似性（DL）等信息對上述三種藥物活性成分的ADME性質進行過濾。麝香則使用BTAMAN-TCM數據庫查找藥物的有效活性成分，在SWISSADME數據庫中對有效成分依據其ADME性質進行過濾，過濾條 件 如 下：GI absorption：high 以 及 Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge5個條件里面滿足2個及以上為YES為符合納入標準。

2 西黃丸活性成分作用靶點的預測

西黃丸中的牛黃、乳香、沒藥三種藥物在TCMSP數據庫中提取活性成分的對應靶點，麝香則使用SwissTargetForecast （http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫提取相應靶標[12]。目的蛋白的標準基因名稱和UniProtID從UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫中獲得，用“人類”對物種進行限制[13]。

3 原發(fā)性肝癌腫瘤基因的提取

在TCGA數據庫中，只提取能翻譯為蛋白的原發(fā)性肝癌轉錄組數據中的基因表達量。其中腫瘤樣本407例，正常組織58例。按照fdr=0.05，logFC=1進行計算，得到較正常組織基因表達異常的腫瘤基因。

4 核心靶點篩選及有效成分-靶標的網絡構建

使用在線工具Venny（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制西黃丸有效活性成分靶點和原發(fā)性肝癌相關靶點的韋恩圖，進而得到交集靶點。使用Cytoscape v3.8.0軟件構建西黃丸有效活性成分與交集靶標之間的調控網絡圖。

5 蛋白質相互作用關系分析（PPI網絡）

將篩選得到的西黃丸抗肝癌的交集靶點蛋白以gene symbol形式上傳到 String 數據庫（https：//stringdb.org/），限定研究物種為人類，置信分數>0.4，進行蛋白與蛋白相互作用分析，得到蛋白質相互作用網絡圖。

6 中心網絡分析及核心基因的篩選

中心網絡分析采用拓撲法。通過中心度（DC）、中間中心度（BC）和貼近中心度（CC），特征向量（EC），基于局部平均連接度的方法（LAC）這5個拓撲參數來評價網絡中節(jié)點的中心屬性。在中心網絡中，以上參數均設定為≥中位值為篩選標準獲得關鍵靶點。

7 西黃丸相關靶點的功能富集分析

使用 R studio中的“clusterProfiler”軟件包對核心基因進行GO（Gene Ontology）富集分析及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。其中，顯著富集的KEGG通路應至少含有3個基因，且P<0.05[14]。

8 分子對接評價

使用AutoDock 4.0軟件評估具有活性化合物的核心基因，該軟件被廣泛用于研究配體與蛋白質的結合構象和結合自由能[15]。

結 果

1 西黃丸生物活性物質的提取

使用TCMSP數據庫及BTAMAN-TCM數據庫檢索西黃丸四種藥物所含的有效成分。從TCMSP數據庫中，共得到牛黃19個化合物和乳香127個化合物，沒藥276個化合物。從BTAMAN-TCM數據庫中檢索到麝香含29個化合物。牛黃、乳香及沒藥通過ADME相關藥代動力學參數OB和DL進行篩選，篩選標準為OB≥30%和DL≥0.18。麝香所含有效成分使用WISSADME數據庫過濾，過濾條件為 GI absorption：high 以及 Lipinski，Ghose，Veber，Egan和Muegge以上5項條件里面滿足2項YES為納入標準。在此基礎上再刪除無對應靶點的化合物后，牛黃含5種化合物，乳香含5種，沒藥含31種，麝香共含8種化合物，綜合以上藥物共鑒定出無重復有效化合物成分共49種（圖1A）。

2 西黃丸有效成分的作用靶點

西黃丸中的牛黃、沒藥、乳香的作用靶點在TCMSP數據庫中提取。在合并重復靶點后，牛黃5種化合物成分對應靶點共5個，沒藥31種化合物成分共對應175個靶點基因，乳香5種化合物成分共對應11個靶點基因。麝香有效成分的作用靶點在SwissTargetPrediction數據庫中按照probability×>0.5進行過濾，合并重復的靶點后，麝香8種化合物成分共對應92個靶點基因。綜合以上，西黃丸中49種化合物確定了245個靶點基因（圖1B）。

3 藥物有效成分及其對應的靶點構建網絡

在UniProt數據庫中將對應的基因名稱轉換為基因符號，利用Cytoscape構建了化合物和靶點基因間的相互作用網絡。如圖1C所示，化合物和靶點（Compounds-Targets）相互作用的二分圖，由294個節(jié)點（化合物49個，靶點基因245個）和513條邊組成。其中，位居前三的重要成分分別為MOL000098（quercetin，槲皮素，138個連接）、CID5281670（Morin，桑色素，72個連接）和MOL000358（beta-sitosterol，β-谷甾醇，28個連接）。這些結果表明，一種化合物可以影響多個靶點，這些靶點可能與西黃丸的抗腫瘤作用有關。

圖1

4 原發(fā)性肝癌差異基因的提取及藥物-腫瘤靶點基因的篩選

在TCGA數據庫中，調取原發(fā)性肝癌轉錄組數據中的基因表達量，其中，腫瘤樣本407例，正常組織對照58例。按照fdr=0.05，logFC=1進行計算，共有6229個基因差異表達，其中，5895個基因表達上調，334個基因表達下調。上調及下調前20位的基因表達如圖2A所示。我們將之前得到的245個藥物靶點基因與6229個肝癌差異基因進行交集，共得到87個交集基因。其中，74個基因表達上調，13個基因表達下調（圖2B）。

5 西黃丸活性成分-原發(fā)性肝癌靶點網絡的構建

使用cytoscape軟件構建了藥物活性成分和交集靶點間的網絡圖（圖2C）。該網絡中共有115個節(jié)點，由28個活性成分和87個腫瘤靶點組成，通過156個相互作用連接。其中MOL000098（quercetin，槲皮素，49個連接），CID5281670（Morin桑色素，27個連接），MOL000358（beta-sitosterol，β-谷甾醇，9個連接）是權重靠前3的藥物有效成分；而靶點中排列靠前的基因分別為PTGS2（14個連接），HSP90AB1（9個連接）、CHRM3及CYP19A1（均為7個連接）。

圖2

6 PPI網絡分析與關鍵活性成分篩選

利用String在線數據庫分析蛋白質與蛋白質的相互作用，構建相關的PPI網絡，并用cytoscape軟件進行可視化。以置信度0.4為閾值，我們在PPI網絡中找到了82個節(jié)點和484個交互。使用cytoscape軟件中的插件cytoNCA軟件對上述網絡中的關鍵基因進行過濾，過濾條件為：Betweenness：21.24276182，Closeness： 0.465517241，Degree：10，Eigenvector： 0.056190023，LAC： 5.0714285715，Network：6.4666666665，共得到27個關鍵基因，如圖3A中黃色圓形所示。用cytoscape軟件中的插件cytoNCA軟件再次對上述網絡中的關鍵基因進行過濾，過濾條件為：Betweenness： 5.763564214，Closeness： 0.65，Degree： 24，Eigenvector： 0.169159561，LAC： 19，Network： 19.95859213，得到 12個關鍵基因，如圖3B 中黃色圓形所示。將這些關鍵基因構建子網絡，這個網絡由12個基因，124條邊組成，如圖3C所示。這12個核心基因被鑒定為中樞基因，包括FOS、CCNB1、CASP8、ESR1、CASP3、EGF、BCL2L1（均為 22個連接）以及MMP9、SRC（均為20個連接）和PTGS2、CDK1、CDK2（均為18個連接）。接下來我們構建了能與12個核心基因相互作用的化合物-靶點調控網絡（圖3D），這個網絡由31個節(jié)點（化合物19個，靶點基因12個），41條邊組成。在藥物活性成分和12個關鍵基因的調控網絡中，對應靶點較多的是來自沒藥的MOL000098（quercetin，槲皮素），對應靶點9個。其次是來自麝香的CID5281670（Morin，桑色素），對應靶點3個。來自沒藥的MOL000358（beta-sitosterol，β- 谷甾醇）及 MOL001002（ellagic acid，鞣花酸），對應靶點均為3個。

圖3

7 活性成分-肝癌靶點網絡GO富集分析和KEGG通路分析

為了研究西黃丸與原發(fā)性肝癌治療相關的相互作用網絡的生物學功能，我們使用clusterprofile R軟件包對12個核心基因進行了GO和KEGG途徑富集分析。分析了三種GO類別，包括細胞組分（CC，cell component）、分子功能（MF，molecular function）和生物過程（BP，biological process）。GO 和 KEGG 途經富集分析結果見圖4A-B。細胞成分顯示與周期蛋白依賴的蛋白激酶全酶復合物，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物的合成以及膜筏，膜微結構域等細胞膜成分密切相關，這些酶類主要參與細胞周期及信號轉導過程，而膜筏及膜微結構域等則參與細胞質膜或胞漿中的蛋白質的合成，一起調節(jié)癌細胞的增殖。分子功能主要涉及凋亡過程及細胞周期過程中重要參與酶類的活性調控，與肝癌細胞的增殖及凋亡息息相關。結合BP結果提示，西黃丸可能調節(jié)與原發(fā)性肝癌相關的生物學過程，如“細胞對化學壓力的反應”、“對活性氧的反應”、“凋亡信號通路的負調控”等。KEGG富集分析結果則提示與原發(fā)性肝癌相關的通路包括“p53信號通路”、“乙型肝炎病毒”、“IL-17信號通路”、“凋亡通路”和“病毒致癌相關通路”（圖4B）。表明西黃丸可能通過與細胞外空間、質膜或胞漿中的蛋白質、酶和轉錄因子結合來調節(jié)癌細胞的凋亡及增殖，從而在原發(fā)性肝癌中表現出抑制作用。我們以p53信號通路為例，觀察上述核心基因在通路中的位置，具體在通路中的位置見圖5。

圖4 西黃丸活性成分對應靶點的 GO（Gene Ontology）及 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析結果

圖5 p53信號通路的KEGG富集圖

8 分子對接

為了驗證化合物與靶點基因之間結合的可能性，我們以p53信號通路為例，做了有效成分與核心基因的分子對接。BCL2L1與槲皮素，最佳結合自由能為-7.9kcal/mol；CASP3與槲皮素，最佳結合自由能為-8.0kcal/mol；CASP3與β-谷甾醇，最佳結合自由能為-8.6kcal/mol；CASP8與槲皮素，最佳結合自由能為-7.6kcal/mol；CASP8與β-谷甾醇，最佳結合自由能為-7.0kcal/mol；CCNB1與槲皮素，最佳結合自由能為-7.4kcal/mol；CDK1與槲皮素，最佳結合自由能為-8.4kcal/mol；CDK1與桑色素，最佳結合自由能為-8.4kcal/mol；CDK2與鞣花酸，最佳結合自由能為-10.1kcal/mol（圖6）。

圖6 原發(fā)性肝癌靶基因BCL2L1、CASP3、CASP8、CCNB1、CDK1、CDK2與藥物有效成分槲皮素、β-谷甾醇、鞣花酸、桑色素的分子對接圖

討 論

根據中醫(yī)辨證論治原則，正氣內虛，肝氣郁結，瘀毒留滯是肝癌形成的主要因素。中醫(yī)藥治療肝癌以扶正祛邪、攻補兼施為基本原則，根據病情進展程度、病程長短具體辨證施治。西黃丸作為具有抗癌作用的經典名方，具有扶正固本、清熱解毒、軟堅散結、消腫鎮(zhèn)痛功效，臨床主要用于肝癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療和輔助治療。在本研究中，我們利用現代網絡藥理學對其可能的活性成分及其抗腫瘤機制進行了分析并得到以下結果。

研究中，我們從公共數據庫中共鑒定出西黃丸四種藥物的49個活性化合物和245個化合物相關靶點，以及6229個肝癌相關靶點。在這些靶點中，有87個靶點在化合物相關靶點和肝癌相關靶點之間共享，提示西黃丸有抗肝癌的作用。通過網絡建設和中心網絡評價，篩選出西黃丸抗肝癌靶點網絡中的12個關鍵基因。在12個關鍵基因的KEGG富集分析結果中，與肝癌相關并排列靠前的3個通路分別為：p53信號通路，乙型肝炎病毒感染相關通路及IL-17信號通路。這些信號通路涉及肝癌的發(fā)生，凋亡及自身免疫過程。說明西黃丸的有效成分可以通過上述信號通路對原發(fā)性肝癌進行多靶點干預。

西黃丸中的四種藥物分別是牛黃、麝香、乳香（醋制）和沒藥（醋制）。牛黃為方中君藥，來源為牛科動物黃?；蛩５母稍锬懡Y石（主要來自于膽囊結石，少數為膽管或肝管結石）。其中的物質主要包含膽紅素、膽汁酸、膽固醇等成分。牛黃味甘，性涼，歸心、肝經，具有清熱解毒、化痰散結，息風定驚功能[16-17]。臣藥麝香為鹿科動物林麝、馬麝或原麝成熟雄體香囊中的干燥分泌物[18]，其物質主要包含麝香酮、降麝香酮、芳活素等有效成分。麝香味辛，性溫，歸心、脾經。具有開竅辟穢、活血散結的作用。佐藥乳香為橄欖科植物乳香樹及同屬植物莖枝樹皮部滲出的膠狀樹脂。其物質主要包含α-乳香脂酸，β-乳香脂酸，蒎烯等成分。乳香性溫，味辛、苦，具有消腫、鎮(zhèn)痛、活血功效。沒藥在西黃丸中為佐藥，是橄欖科植物沒藥樹及同屬其他種植物樹皮滲出的油膠狀樹脂。其成分包括倍半菇、甾體、木脂素類等物質。沒藥性平、味苦，歸心、肝脾經。具有活血止痛、消腫生肌功效[19]。全方具有清熱解毒、化痰散結、活血化瘀之功效，祛邪而不傷正。

以往研究表明，西黃丸可通過抑制腫瘤細胞生長、侵襲和腫瘤組織內血管生成，通過提高機體免疫力，逆轉免疫抑制微環(huán)境，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移。如在Xinye L等人的研究中，西黃丸可以通過調控PI3K/AKT信號通路，JNK1/AP-1信號通路或MEKK1/SEK1等信號通路來抑制腫瘤生長和增殖[20-21]；在Wang X等人的研究中，西黃丸可以通過降低 EMT 轉錄因子 ZEB 1（zinc finger E-box-binding protein 1）的活性，下調其下游靶基因 ERK 1/2、E- 鈣黏蛋白、閉鎖蛋白（occludin）和連接附著分子（JAM 1）等因子的表達水平，從而逆轉ZEB 1介導的EMT，實現抗結腸癌復發(fā)、侵襲轉移的目的[22]；此外，研究還發(fā)現，西黃丸還可以通過促進Th1細胞增殖并分泌IL-2和IFN-γ，對免疫微環(huán)境進行調控，進而直接或間接發(fā)揮抗乳腺癌作用[7]。

在本研究中，西黃丸活性成分對應肝癌靶點的調控網絡中，12個關鍵基因富集在與原發(fā)性肝癌相關的通路上，包括“p53信號通路”、“乙型肝炎病毒”、“IL-17信號通路”，“凋亡通路”及“病毒致癌相關通路”。也就是說，西黃丸可以通過調控細胞凋亡，腫瘤免疫及乙型肝炎病毒感染等相關通路而發(fā)揮抗肝癌作用。我們這些結果與以往研究相符，說明了我們預測結果的可靠性。

在西黃丸調控肝癌靶點網絡中，西黃丸中的28種活性成分對應了肝癌的87個靶點。從西黃丸藥物活性成分的來源來看，沒藥的活性成分有17個，麝香有8個，乳香有3個。從藥物活性成分對應靶點的數量來看，以沒藥中的MOL000098（quercetin，槲皮素）對應靶點最多，有49個靶點；其次為麝香中的CID5281670（Morin，桑色素）對應27個靶點；排列第三的是沒藥中的MOL000358（β-sitosterol，β-谷甾醇）對應9個靶點。當進行權重篩選后，在12個核心基因對應關系里面，依然是上述三個活性成分對應較多的靶點。來自沒藥的MOL000098（quercetin，槲皮素）和MOL000358（β-sitosterol，β-谷甾醇）分別對應靶點9個和3個。麝香中的CID5281670（Morin，桑色素）對應靶點3個。因此西黃丸抗肝癌的有效成分中的最重要的是槲皮素、β-谷甾醇和桑色素。

槲皮素（quercetin）是一種在腫瘤領域極具潛力的黃酮類化合物，廣泛存在于各種植物材料（葉子、谷物、水果和蔬菜）以及常見的食品和飲料中。槲皮素的抗癌作用依賴于其通過調控細胞周期素、促凋亡、PI3K/Akt和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等分子途徑抑制細胞增殖、誘導凋亡、引起細胞周期阻滯和抑制有絲分裂過程。例如槲皮素以時間和劑量依賴的方式抑制SKOV-3卵巢癌細胞[23]和MCF-7乳腺癌細胞[24]的增殖并增加促凋亡生物標記物Survivin的水平。在高濃度時槲皮素還能抑制細胞周期從G0/G1期向G2/M期進展。槲皮素能夠降低B淋巴瘤細胞（PEL，一種侵襲性B細胞淋巴瘤細胞）BC3、BCBL1和BC1的細胞活力和生長，但對正常B淋巴細胞沒有細胞毒作用[25]。槲皮素還可以通過失活Akt-mTor通路[26]和缺氧誘導因子-1α信號[27]，誘導胃和乳腺癌細胞保護性自噬。

β-谷甾醇是分布于多種植物中含量最豐富的植物甾醇，它對多種癌癥具有抑制活性。其抗癌活性與刺激凋亡細胞死亡、細胞周期阻滯和激活鞘磷脂周期有關。Zhao Y[28]等的研究表明，β-谷甾醇在體外對SGC-7901人胃癌細胞具有明顯的生長抑制和誘導凋亡作用。Baskar[29]發(fā)現β-谷甾醇能減弱β-連環(huán)蛋白和增殖細胞核抗原的表達，是一種潛在的治療結腸癌的抗癌藥物。Jourdain[30]發(fā)現β-谷甾醇對前列腺癌癌細胞有低生長抑制作用。

桑色素（Morin）是一種黃酮類化合物，廣泛分布于無花果、杏仁和板栗中[31]。桑色素具有多種生物學特性，如抗炎、抗氧化、抗突變[32]。越來越多的證據也顯示桑色素通過抑制多種癌細胞株的增殖、促進凋亡和化療敏感性而具有抗癌作用[31-33]；如桑色素能通過降低細胞存活率和增殖能力以及增加凋亡誘導作用實現對TOV-21G和SK-OV-3卵巢癌細胞的抗腫瘤活性[34]，同時能增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。桑色素能夠部分通過抑制Akt的激活來抑制高轉移乳腺癌細胞的腫瘤進展和EMT過程[34]。桑色素通過激活hippo信號通路來靶向細胞生存分子，如NF-κB p65和β-catenin，從而促進肝癌細胞凋亡[35]。

綜上所述，本研究初步預測了西黃丸抗肝癌的分子機制。這些發(fā)現為深入了解西黃丸治療肝癌的潛在機制提供了依據，也為研究該中藥復方更為復雜的作用機制以及為進一步的實驗驗證其作用機制提供了參考。

不足及展望

中草藥成分復雜，僅通過對藥物有效成分及靶點的成分鑒定和預測，無法明確化合物之間是否有協(xié)同或拮抗作用；此外，我們利用PPI網絡選擇了核心基因，它們通常是這些重要信號通路中的上游分子或中心分子。然而，在原發(fā)性肝癌的發(fā)病機制中，仍存在多個下游蛋白。因此，在未來的工作中發(fā)現和鑒定更多與這些下游蛋白相互作用的化合物是很重要的。

結 論

西黃丸內的槲皮素、β-谷甾醇和桑色素等有效成分可通過作用于p53信號通路、IL-17信號通路和凋亡通路上的多個關鍵基因發(fā)揮多靶點抗肝癌作用。