一株野生球蓋菇的鑒定及其菌絲生物學(xué)特性研究初報(bào)

張澤乾 劉 虹

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原 030031）

大球蓋菇Stropharia rugosoannulataFarl.ex Murrill隸屬于傘菌目Agaricales，球蓋菇科Strophariaceae，球蓋菇屬Stropharia，是一種著名的大型真菌[1]，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的食用菌之一，是一種重要的食、藥用真菌。該菌味美色優(yōu)，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有增強(qiáng)人體免疫力、降低血糖等保健及藥用價(jià)值[2-6]。

我國(guó)野生球蓋菇資源比較匱乏，從已有發(fā)表的關(guān)于野生球蓋菇的報(bào)道來看，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的野生球蓋菇主要特征為紅色、黃色或棕色，主要分布于我國(guó)臺(tái)灣、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南等省區(qū)[7-10]。

研究對(duì)象為采自山西省太原市婁煩縣云頂山的一株棕黃色野生大球蓋菇，該物種個(gè)體中到大型，肉質(zhì)肥厚。為了開發(fā)利用該野生資源，筆者在形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)該菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，以期為該野生菌株的馴化栽培、開發(fā)利用和后期規(guī)模化栽培提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）標(biāo)本：野生球蓋菇菌株（SP1），2020年9月采自山西省婁煩縣云頂山海拔1 680 m（北緯37°52'43″，東經(jīng)111°36' 06″）的櫟樹林草地，樣本新鮮且無病蟲害。組織分離法獲得純菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上純化后，篩選出菌絲生長(zhǎng)旺盛的菌株作為母種，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，編號(hào)HSA361。

（2）母種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉46 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL；pH自然。

（3）平板培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.03 g，硫酸鐵0.1 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

以體視顯微鏡和手持放大鏡觀察子實(shí)體宏觀特征，主要包括子實(shí)體、菌蓋和菌柄的形狀、顏色、表面有無鱗片以及菌褶的特征等；光學(xué)顯微鏡下觀察子實(shí)體顯微結(jié)構(gòu)；以蒸餾水或3%KOH 制作水封片，用棉蘭和Melzer 試劑檢驗(yàn)擔(dān)孢子壁是否喜藍(lán)以及淀粉質(zhì)反應(yīng)[11-13]。

1.2.2 分子鑒定

提取目標(biāo)樣本（SP1）DNA，完成PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增在FTGRAD2D 型PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行，ITS 測(cè)序工作由北京中科希林生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。測(cè)序后ITS 基因序列通過BLAST 程序與GenBank 數(shù)據(jù)庫中所收錄的ITS 基因序列進(jìn)行同源性比較核對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對(duì)樣本進(jìn)行鑒定[13-14]。

1.2.3 碳源試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基為對(duì)照，分別以相當(dāng)碳量的麥芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇代替其中的葡萄糖，培養(yǎng)基按配方制備好后于121.3 ℃，滅菌20 min 后備用。將SP1 供試菌株接種到裝有活化培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中央，于25 ℃暗培養(yǎng)10～12 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)茁壯一致的菌落，在其邊緣用完全滅菌的打孔器（直徑6 mm）取生長(zhǎng)一致的接種塊移至供試碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中心，置25 ℃暗培養(yǎng)10 d。按照十字交叉法每隔3 d 用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度[15]，每個(gè)處理重復(fù)5 次。同時(shí)觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)及菌落形態(tài)。

1.2.4 氮源試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基為對(duì)照，分別以酵母膏、牛肉膏、麩皮、硫酸銨、尿素代替其中的蛋白胨。每個(gè)處理重復(fù)5次。將試驗(yàn)菌株大小一致的菌種塊接種到上述供試培養(yǎng)基中央，置25 ℃暗培養(yǎng)10 d 后，并觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度。操作方法同碳源試驗(yàn)。

1.2.5 碳氮比試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，碳氮總量23 g，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的碳氮比設(shè)置5 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5 次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.2.6 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌種接種在平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度設(shè)15 ℃、18 ℃、21 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃6 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.2.7 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)上用1.0 mol/L NaOH 溶液和1.0 mol/L HCl 溶液調(diào)整PDA 平板培養(yǎng)基酸堿度[16]，共設(shè)pH5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 七個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS、LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

標(biāo)本擔(dān)子果中到大型（圖1）。菌蓋幼時(shí)半球形，成熟后漸平展，幼時(shí)直徑2.5～4.0 cm，成熟后5～12 cm，幼時(shí)灰褐色、褐色或黃褐色，成熟后變?yōu)闇\黃色或黃褐色，表面有褐色鱗片，邊緣有內(nèi)菌幕殘余。菌褶直生至彎生，灰紫色，漸變?yōu)楹稚⒒液稚^密，邊緣灰白色。菌肉白色，傷不變色，厚達(dá)2 cm。菌柄中生，長(zhǎng)4～10 cm，粗1.2～2.0 cm，圓柱狀，或基部變粗成棒狀，白色，表面有片狀或棉絮狀鱗片，鱗片易脫落以至于成熟后近光滑，早期中實(shí)，后內(nèi)部漸松軟，基部沒有菌索。菌環(huán)常缺，如有為膜質(zhì)或絮狀，位于菌柄中上部。

圖1 喜楊球蓋菇Stropharia populicola生態(tài)照

擔(dān)孢子橢圓形，（5.5～7.5）μm×（3.5～4.5）μm，褐色，表面光滑，具有一個(gè)退化的芽孔。擔(dān)子柱棒狀，（25～30）μm×（10～12.5）μm，4 孢子型，小梗短于1.5μm。 緣 囊 體 大 量，（32.5～50）μm×（12.5～17.5）μm，棒狀至近梭形，頂部有或沒有短凸起，薄壁。子實(shí)層除擔(dān)子外有3 種成分，（1）黃囊體，棒狀或梨形，（27.5～32.5）μm×（7.5～12.5）μm，頂部有或沒有短指狀凸起，薄壁，內(nèi)含黃色無定形物質(zhì)；（2）側(cè)生薄壁囊狀體，罕見，大小為42.5μm×15.0μm，瓶形或近梭形；（3）棘狀類囊體（acanthocyte），具6～13條放射狀刺棘，長(zhǎng)47.5μm，基部直徑5μm，厚壁。子實(shí)層菌髓組織菌絲平行排列，菌絲無色，直徑5～10μm。菌蓋皮層組織菌絲無色或淺黃色，薄壁，直徑5.0～7.5μm。菌蓋表面鱗片有成束菌絲聚集而成，菌絲直徑3.5～8.5μm，無色或淡黃色，薄壁。菌肉組織菌絲薄壁，無色，直徑5～15μm。菌柄皮層菌絲平行排列，菌絲無色，薄壁，直徑5～15μm。鎖狀聯(lián)合罕見[18]。

2.2 分子比對(duì)結(jié)果

提取的SP1 菌株ITS 和nrLSU 片段在GenBank上比對(duì)結(jié)果（表1），來自中國(guó)山西省云頂山地區(qū)的野生球蓋菇HSA361 經(jīng)樣本分子比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定可以確定研究物種是喜楊球蓋菇Stropharia populicola[18]。

表1 球蓋菇（SP 1）樣本及其GenBank比對(duì)結(jié)果

2.3 供試碳源對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

碳源是食藥用菌生長(zhǎng)所必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[19]。由表2可以看出，供試碳源培養(yǎng)基對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度會(huì)產(chǎn)生很大的影響。以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落呈圓形而完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，平均生長(zhǎng)速度最快，為2.81 mm/d，顯著快于其他碳源；碳源為甘露醇或麥芽糖表現(xiàn)次之，果糖表現(xiàn)最差，菌絲乳白色、稀疏，生長(zhǎng)勢(shì)弱，平均生長(zhǎng)速度最慢，為1.76 mm/d。

表2 供試碳源對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 供試氮源對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

氮源是食用菌生長(zhǎng)的第二大營(yíng)養(yǎng)[20]。不同的氮源對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、平均生長(zhǎng)速度影響顯著（表3）。在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上，球蓋菇（SP1）的菌絲潔白，菌落形態(tài)橢圓形、完整、濃密、生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，平均生長(zhǎng)速度最快，為2.42 mm/d，對(duì)比其他氮源處理差異顯著；氮源為蛋白胨、硫酸銨表現(xiàn)次之；尿素表現(xiàn)最差，菌絲僅在接種塊周圍生長(zhǎng)甚至不生長(zhǎng)。

表3 供試氮源對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 試驗(yàn)培養(yǎng)基碳氮比對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可以看出，球蓋菇（SP1）菌絲在碳氮比為5∶1～25∶1 的培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)勢(shì)和平均長(zhǎng)速呈顯著差異。在碳氮比為10∶1 的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，平均長(zhǎng)速最快，為2.71 mm/d，與碳氮比5∶1、15∶1、20∶1、25∶1 差異顯著；其次為碳氮比5∶1和15∶1，二者差異不顯著，但與其他碳氮比菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著；表現(xiàn)最差的為碳氮比25∶1，菌絲稀疏，生長(zhǎng)勢(shì)弱，生長(zhǎng)速度最慢。

表4 試驗(yàn)培養(yǎng)基碳氮比對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5 可以看出，球蓋菇（SP1）的菌絲在15～30 ℃培養(yǎng)均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)勢(shì)和平均長(zhǎng)速差異顯著。菌絲生長(zhǎng)最適宜的溫度為25 ℃、21 ℃，生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)、平均長(zhǎng)速最快，分別為2.58 mm/d和2.55 mm/d，與其他處理差異顯著；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于25 ℃時(shí)，菌絲平均長(zhǎng)速隨溫度的升高呈逐漸加快的趨勢(shì)，且生長(zhǎng)勢(shì)趨強(qiáng)；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于25 ℃時(shí)，菌絲平均長(zhǎng)速隨溫度的升高呈逐漸下降的趨勢(shì)，且生長(zhǎng)勢(shì)趨弱。

表5 培養(yǎng)溫度對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

2.7 培養(yǎng)基pH對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

由 表6 可 以看出，培 養(yǎng)基pH 5.0～8.0 球 蓋菇（SP1）菌絲均可生長(zhǎng)，且隨著pH 的升高，菌絲平均長(zhǎng)速呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，以培養(yǎng)基pH 7.0、pH7.5 菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)最好：菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，平均長(zhǎng)速最快，分別為2.69 mm/d、2.55 mm/d，菌落形態(tài)為橢圓形，形態(tài)完整，濃密，與其他pH 處理菌絲生長(zhǎng)差異顯著；pH6.0 及以下或pH 8.0 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱，菌絲平均長(zhǎng)速顯著下降。

表6 培養(yǎng)基pH對(duì)球蓋菇（SP1）菌絲生長(zhǎng)的影響

3 小結(jié)

經(jīng)形態(tài)學(xué)和DNA 序列比對(duì)，確認(rèn)采自山西省云頂山地區(qū)的野生球蓋菇是喜楊球蓋菇Stropharia populicola。

菌絲培養(yǎng)特性研究結(jié)果，喜楊球蓋菇菌絲生物學(xué)因子與陳永剛等[21-22]研究大球蓋菇的結(jié)果相似，表明喜楊球蓋菇菌絲生長(zhǎng)所需主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與大球蓋菇相似。