甘藍色膜褶菌菌絲體培養(yǎng)特性研究

王 月 任梓銘 陸 珠 于延申 田 松 遲翔丹 宮慶瑞 耿 偉

（吉林省蔬菜花卉科學研究院，吉林長春 130000）

甘藍色膜褶菌Hymenopellis raphanipes（Berk.）R.H.Petersen，隸屬于擔子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、傘菌目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae、膜褶菌屬Hymenopellis[1]，又名長根菇、長根小奧德蘑、鱗柄小奧德賽蘑等[2]，外形酷似野生雞菌，商品名為黑皮雞，是近年來商業(yè)化栽培的熱門食用菌[3]，享有“食用菌女王”的美譽[4]。野生甘藍色膜褶菌夏秋季單生或群生于闊葉林中地上，其假根著生于地下腐木或腐殖層上，為木腐型真菌，在我國多分布于滇、粵、閩、桂、川等地，屬中高溫型食用菌[5]。該菌味道鮮美，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素和微量元素等，所含的長根菇素具有降壓功效[6]。

國內(nèi)栽培甘藍色膜褶菌的歷史較短，2007 年在山東濟寧首次栽培成功[7]，2013 年實現(xiàn)周年生產(chǎn)[8]。目前，我國多地（山東省、四川省、廣東省、湖南省等）人工栽培甘藍色膜褶菌已具一定規(guī)模[9]，但在吉林省栽培面積小，產(chǎn)量少且質(zhì)量不穩(wěn)定，無法滿足市場需求。筆者對甘藍色膜褶菌子實體進行組織分離及分子生物學鑒定，探索不同碳氮源、溫度及pH對其菌絲生長的影響，篩選出適合其生長的營養(yǎng)及環(huán)境條件，為培育高質(zhì)量甘藍色膜褶菌菌絲，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）供試菌株：甘藍色膜褶菌菌株（編號為OUE）保藏于吉林省蔬菜花卉科學研究院食用菌研究所，子實體采自吉林省菇鄉(xiāng)生物科技股份有限公司出菇溫室（圖1）。

圖1 甘藍色膜褶菌子實體

（2）培養(yǎng)基：菌株活化培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，七水硫酸鎂1.5 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離與純化

采用組織分離法分離純化菌株。選擇菌蓋肥厚、無病蟲害的子實體，用無菌水清洗表面污物，再用75%乙醇消毒表面，用手術(shù)刀縱向切開子實體，在菌蓋、菌柄交界處取0.5 cm?0.5 cm 菌肉組織，移入菌株活化培養(yǎng)基（斜面）中央，恒溫25 ℃黑暗培養(yǎng)。定期觀察菌絲生長情況，待菌絲長至培養(yǎng)基斜面1/2 處時，挑取菌落邊緣新生菌絲至平板培養(yǎng)基中央培養(yǎng)后，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，即獲得純化菌株。

1.2.2 ITS序列測定

用DNA 提取試劑盒（試劑盒購于北京酷來博科技有限公司）進行基因組DNA提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量和濃度。PCR 擴增用真菌ITS通用引物ITS1 和ITS4，在BioRad My Cycle 型PCR儀上進行擴增，反應(yīng)體系見表1，程序設(shè)定見表2。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 程序設(shè)定

測序結(jié)果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，BLAST 在線比對，用Mega 6.0 軟件中的Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 培養(yǎng)基碳源篩選試驗

用等質(zhì)量的可溶性淀粉、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制含不同碳源培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK）。用滅菌打孔器（直徑7 mm）取相同菌齡的菌種塊，接種于含供試碳源培養(yǎng)基平皿中央，每處理3 次重復，25 ℃避光培養(yǎng)。菌絲萌發(fā)后測量菌落直徑（十字交叉法），至菌絲長滿平板或停止生長為止，記錄菌絲形態(tài)及計算菌絲長速。

菌絲平均生長速度（mm/d）的計算公式：

公式中D表示菌落直徑（mm），d表示培養(yǎng)時間（d），7是接種塊直徑。

1.2.4 培養(yǎng)基氮源篩選試驗

用等量的尿素、硝酸鉀、硫酸銨、牛肉膏、酵母浸膏為氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，配制含不同氮源的培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK）。菌絲的培養(yǎng)及生長速度的測定計算方法同1.2.3。

1.2.5 培養(yǎng)溫度篩選試驗

用7 mm滅菌打孔器取菌齡相同的菌種塊，接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平皿中央，分別置18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每處理3 次重復。菌絲生長速度的測定計算方法同1.2.3。

1.2.6 培養(yǎng)基pH篩選試驗

用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，高壓滅菌冷卻后接種試驗菌株，25 ℃避光培養(yǎng)，每處理3 次重復。菌絲生長速度的測定計算方法同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel及DPS7.05統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子鑒定結(jié)果

測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，與已知序列KX688247Hymenopellis raphanipes的同源性高于99%。以MH877768Psathyrella candolleana作為外類群，選取10 個同源性較高的序列，與OUE一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由圖2可知，供試菌株與Hymenopellis raphanipes序列聚為一類，Psathyrella candolleana單獨存在于一個分支。分子生物學水平鑒定結(jié)果，試驗菌株OUE為甘藍色膜褶菌。

圖2 基于ITS rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 碳源篩選結(jié)果

由表3可知，OUE菌株在供試碳源培養(yǎng)基上，菌絲生長速度（平均生長速度，下同）無顯著差異，但菌絲長勢有所不同。在碳源為果糖的培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快，為8.54 mm/d，在碳源為乳糖的培養(yǎng)基上菌絲生長最慢，僅4.5 mm/d。在以果糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲長勢最濃密，在含蔗糖、葡萄糖培養(yǎng)基上次之，在含乳糖培養(yǎng)基上最稀疏。綜合菌絲生長速度和長勢，培養(yǎng)菌株OUE的培養(yǎng)基最佳碳源為果糖，其次為麥芽糖。

表3 供試碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)甘藍色膜褶菌菌絲生長情況

2.3 氮源篩選結(jié)果

OUE 菌株在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不能生長，在含其他氮源培養(yǎng)基上菌落均呈絨毛狀，白色，圓形。由表4可知，在含供試氮源培養(yǎng)基上，OUE菌株菌絲生長速度為4.7～8.02 mm/d，在酵母浸膏培養(yǎng)基上生長速度最快，為8.02 mm/d，但與含硝酸鉀、CK 培養(yǎng)基上菌絲生長速度無顯著差異，與含牛肉膏、硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲長速差異顯著，含硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲長速最慢（4.7 mm/d）。在含酵母浸膏或硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲濃密，但在硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲長速顯著慢于酵母浸膏，硝酸鉀、CK、牛肉膏次之。綜合菌絲長勢、生長速度，OUE 菌株菌絲培養(yǎng)基的最佳氮源為酵母浸膏。

表4 供試氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)甘藍色膜褶菌（OUE）菌絲生長情況

2.4 培養(yǎng)溫度篩選結(jié)果

由表5 可知，培養(yǎng)溫度18～24 ℃菌絲長速隨著培養(yǎng)溫度的升高而加快，但溫度繼續(xù)升高后，菌絲長速呈下降趨勢。培養(yǎng)溫度，24 ℃、26 ℃、28 ℃菌絲長速無極顯著差異。培養(yǎng)溫度24 ℃、26 ℃，菌絲長勢最濃密，20 ℃、22 ℃、28 ℃菌絲長勢次之，18 ℃、30 ℃下菌絲長勢最弱，菌落稀疏。綜合菌絲長勢和生長速度，24～26 ℃是OUE 菌株菌絲最適生長溫度范圍。

表5 不同培養(yǎng)溫度下甘藍色膜褶菌（OUE）菌絲生長情況

2.5 培養(yǎng)基pH篩選結(jié)果

由表6可知，OUE 菌株菌絲在試驗pH 培養(yǎng)基上均能生長，且菌絲長勢及菌落形態(tài)均無顯著差異。菌絲生長速度依次為pH5.5＞pH6.0＞pH5.0＞pH7.0＞pH9.0＞pH6.5＞pH7.5＞pH8.5＞pH4.5＞pH8.0。培養(yǎng)基pH5.5，菌絲生長速度最快，為7.38 mm/d，培養(yǎng)基pH8.0，菌絲生長速度最慢，僅4.54 mm/d。培養(yǎng)基pH 為5.0、5.5和6.0時，菌絲長速無極顯著差異。綜合菌絲長勢和生長速度，OUE 菌株菌絲培養(yǎng)基的最適pH為5.5～6.0。

表6 不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)甘藍色膜褶菌菌絲生長情況

3 結(jié)論與討論

分子生物學鑒定結(jié)果，供試OUE 菌株與Hymenopellis raphanipes的同源性高于99%，與下載的Hymenopellis raphanipes序列聚成一類，確定OUE 菌株為甘藍色膜褶菌Hymenopellis raphanipes。

甘藍色膜褶菌菌株OUE 菌絲培養(yǎng)基的最佳碳源為果糖，其次為麥芽糖，與譚偉等[10]、徐兵等[11]的研究結(jié)果一致；在乳糖為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲平均長速為4.50 mm/d，與李建宗[12]的研究結(jié)果（在有乳糖的培養(yǎng)基上完全不能生長）不同；OUE 菌株菌絲培養(yǎng)最佳氮源為酵母浸膏，不能在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長，與譚偉等[10]、李建宗[12]、張磊等[13]、熊雪等[14]的研究結(jié)果一致；OUE 菌株菌絲生長最適溫度為24～26 ℃，最適培養(yǎng)基pH 為5.5～6.0，與羅影等[15]的研究結(jié)果一致，但與張磊等[13]得出的最適pH為7.0的研究結(jié)果不同。

甘藍色膜褶菌的菌絲培養(yǎng)特性因菌株而異，而培養(yǎng)基的碳氮比對菌絲生長影響顯著，筆者未進行碳氮比研究，今后應(yīng)進行培養(yǎng)基的最佳碳氮比探索。研究為培育高質(zhì)量甘藍色膜褶菌菌絲，實現(xiàn)其規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。