2019—2021 年食品微生物能力驗證的結果分析與討論

李文綺，李自芹，賈文婷

（1. 石河子質量與計量檢測所，新疆石河子 832000；2. 新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆石河子 832000）

0 引言

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界中，極易污染空氣、水源、食物等，均是引起細菌性食物中毒的病原菌，也是人獸共患病原菌，可導致人和動物的多種疾病，嚴重危害人體的健康[1-3]。我國GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》[4]和GB 31607—2021《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》[5]均要求：涉及食品生產加工環節、經營銷售環節，都應采取相應措施降低食品中致病菌的含量。其中，GB 29921—2021 涉及的13 類食品，5 類中規定了單核細胞增生李斯特氏菌的限量、8 類中規定了金黃色葡萄球菌的限量、13 類中規定了沙門氏菌的限量[4]；GB 31607—2021 涉及的3 類散裝食品，1 類中規定了單核細胞增生李斯特氏菌的限量、3 類中均規定了沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的限量[5]。由此可見，這幾類致病菌分布之廣，尤其是沙門氏菌，居所有致病菌首位，具有極大的安全隱患。

菌落總數和大腸菌群是國內外通用的食品污染常用指示菌，是評價食品衛生狀況的重要指標，長期食用菌落總數和大腸菌群超標的食物會危害人體健康[6-7]，故各地監管部門將其列為食品安全監控的常規項目。

因此，對上述微生物的準確檢測具有重要的意義。能力驗證是體現實驗室檢測能力和實現實驗室質量控制的有效手段，尤其是在微生物檢驗中。因此，本機構每年申請參加一定數量的微生物能力驗證活動，現將2019—2021 連續3 年的能力驗證情況報告如下，以期給同類檢測機構一些參考和指導。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

連續3 年能力驗證測試樣品見表1。

表1 連續3 年能力驗證測試樣品

1.2 儀器與試劑

儀器：JE3002 型電子天平（0.01 g），上海浦春計量儀器有限公司產品；DZKW-D-6 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司產品；Tal boys 型旋渦混合器，美國公司產品；PHS-3C 型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；YXQ-LS-50S Ⅱ型和YXQ-LS-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器（2 臺）、BSC-1300 ⅡA-B3 型生物安全柜、SPX-150B-Z 型生化培養箱、3 臺BSP-150 型生化培養箱（滅菌鍋、生物安全柜和培養箱），上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；OLYMPUS BX41 型生物顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社產品。

試劑：0.85%的無菌生理鹽水（氯化鈉AR），天津市致遠化學試劑有限公司提供；緩沖蛋白胨水（BPW），廣東環凱微生物科技有限公司提供。

微生物能力驗證測項目所需試劑見表2。

表2 微生物能力驗證測項目所需試劑

1.3 檢驗方法

依據GB 4789 規定的相關微生物項目和測試試樣附帶的參試指導書的要求進行檢測。

能力驗證測試樣品檢驗方法見表3。

表3 能力驗證測試樣品檢驗方法

1.4 檢驗步驟

測試樣品的前處理均嚴格按照附帶的參試指導書進行，每個試驗做3 組空白對照（無菌室和生物安全柜環境監測、生理鹽水空白對照、培養基空白對照） 各2 個平皿。

1.4.1 沙門氏菌檢測

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到225 mL BPW 中，充分渦旋混勻，于36 ℃條件下培養16 h后，分別取1 mL 樣品勻液接種于10 mL 的TTB 增菌液和10 mL 的SC 增菌液中，將TTB 增菌液于42 ℃、SC 于36 ℃下培養23 h 后，分別劃線轉種BS 平板（36 ℃培養47 h） 和沙門顯色平板（36 ℃培養23 h）后挑取典型的菌落進行生化鑒定。

1.4.2 金黃色葡萄球菌檢測

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到0.85%滅菌鹽水225 mL 中，旋渦混勻，制成10-1的樣品勻液，再吸取10-1的樣品勻液1 mL，加入到生理鹽水9 mL 中，重復上述操作，逐級稀釋成10 倍系列梯度的樣品勻液。每個稀釋度分別取0.3 mL，0.3 mL，0.4 mL 涂布3 塊BP 平板，于36 ℃條件下培養46 h，詳細記錄每個平板的菌落數。挑選典型的菌落分別做染色鏡檢和血凝試驗；同時劃線接種血平板（于36 ℃下培養22 h） 后觀察菌落形態。

1.4.3 菌落總數檢測

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到0.85%滅菌鹽水225 mL 中，旋渦混勻，依次制作10-1~10-8的樣品勻液，每個稀釋梯度（包括樣品原液） 各取1 mL樣液加入到平皿內（不少于2 個平皿）。及時取瓊脂培養基18~20 mL 傾注平皿，充分混勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層約4 mL 培養基（防止菌落蔓延、造成計數不準）。待完全凝固后，將培養皿倒置于36 ℃生化培養箱中培養46 h，選擇典型的菌落計數。

1.4.4 單核細胞增生李斯特氏菌檢測

取25 g 制備的樣品，加入到225 mL 的LB1 增菌液中混均勻，于30 ℃下培養23 h 后，吸取0.1 mL 轉種于10 mL 的LB2 增菌液中，置于30 ℃下培養20 h，取培養液畫線接種顯色平板和PALCAM 平板，36 ℃培養28 h，挑取可疑菌落接種木糖和鼠李糖發酵管，同時畫線接種TSA-YE 平板，均于36 ℃下培養20 h后，選擇木糖-、鼠李糖+的純培養物繼續進行生化鑒定。

1.4.5 大腸菌群檢測

從制備的樣品原液中取25 mL，置于0.85%滅菌生理鹽225 mL 水中，旋渦混勻，依次制作10-1~10-6的樣品勻液，每個稀釋梯度（包括樣品原液） 各取1 mL 樣液加入到平皿內（不少于2 個平皿）。及時取瓊脂VRBA 18~20 mL 傾注平皿，充分混勻，同2.4.3進行覆蓋。待完全凝固后，將平皿倒置于36 ℃生化培養箱培養45 h，選擇典型的菌落計數。同時接種BGLB 管，于36 ℃條件下培養36 h，產氣的肉湯管對應大腸菌群陽性。

2 結果與分析

3 組空白對照均無菌落生長。

2.1 沙門氏菌

2 個樣在BS 平板和顯色平板上均有可疑菌落生長，各挑取2 個可疑菌落進行生化鑒定。

沙門氏菌生化鑒定檢測結果見表4。

表4 沙門氏菌生化鑒定檢測結果

2.2 金黃色葡萄球菌

BP 平板和血平板上均有可疑菌落生長，詳細記錄每個梯度的菌落數，同時從BP 平板挑取10 個可疑菌落進行鑒定，染色鏡檢、血平板培養、BHI 培養、血漿凝固酶試驗均為陽性。

金黃色葡萄球菌檢測結果見表5。

表5 金黃色葡萄球菌檢測結果

2.3 菌落總數（2020 年和2021 年）

2020 年2 個樣品的結果均偏小。2021 年2 個樣品的結果均為滿意。

連續2 年的樣品菌落總數檢測結果見表6。

表6 連續2 年的樣品菌落總數檢測結果

2.4 單核細胞增生李斯特氏菌

20-P928 樣在PALCAM 平板上有小的灰綠色圓形菌落生長，在李斯特菌顯色平板上有大的乳白色菌落生長，挑取純培養的2 個可疑菌落進行鑒定。20-E866 樣在PALCAM 平板和李斯特菌顯色平板上，均無菌落生長。

單核細胞增生李斯氏菌特檢測結果見表7。

表7 單核細胞增生李斯氏菌特檢測結果

2.5 大腸菌群

選取15~150 CFU 的平板計數紫紅色的典型菌落，20-J492 樣10-3稀釋度平板上10 個菌落均產氣；20-L017 樣10-1稀釋度平板上10 個菌落均產氣，進行大腸菌群檢測。

大腸菌群檢測結果見表8。

表8 大腸菌群檢測結果

3 結論與討論

實驗室參加的5 項能力驗證結果評價均為滿意，其中菌落總數首次結果不滿意，2020 年的2 個樣品的檢測結果均偏小，經過分析，主要存在3 個方面的原因：一是倒平板時未進行覆蓋，菌落生長過程中出現蔓延，導致計數出現誤差；二是對蔓延的菌落計數不規范，造成數值偏小；三是對標準理解不透，選取了菌落數在30~300 CFU 范圍蔓延生長的平板進行計數，導致計算公式選用錯誤，結果偏低。針對以上原因，立即采取了糾正措施，該項目通過再次參加能力驗證取得了滿意的結果。

實驗室通過對2019—2021 年參加的微生物能力驗證項目進行分析，總結出如下注意事項和質控點，供相關的微生物實驗室參考。

3.1 樣品接受、制備、稀釋環節

（1） 樣品接受。實驗室應隨時關注樣品寄送情況，及時接受。接到樣品后，首先應檢查樣品性狀和包裝情況，確認樣品無異樣后方可開展檢驗。若不能立即檢測，應嚴格按照參試指導書要求的環境溫度先行保存，防止樣品中原有微生物的狀況發生變化[13]。

（2） 樣品制備。樣品制備應嚴格依據隨樣參試指導書的要求進行，尤其是定量檢驗的微生物項目，西林瓶中的樣品是一個不可分割的整體，應確保盡可能充分地轉移到稀釋液中。

（3） 樣品稀釋。能力驗證的樣品復雜多樣，無法預估其污染的狀況，樣品稀釋過程盡可能多制備幾個稀釋梯度，一般不少于6 個，且每步操作均應量取準確。

3.2 菌落培養、分離、挑取環節

無論是定性檢驗還是定量檢驗，增菌、分離和純化培養的步驟尤其重要。選擇實驗室常用的增菌液和特異性分離培養基有助于目標菌的檢出和計數。分離培養時建議使用多種培養基雙重選擇，對菌落形態典型、顯色的選擇培養基優先選用，以便有效地分離到目標菌。平板劃線應盡可能地分離出單個菌落，定性項目的生化試驗和血清學試驗選擇營養瓊脂上純培養的細菌進行，定量項目在計數時應詳細記錄典型的菌落數，進行后續鑒定時，應盡可能多地挑取可疑菌落，以確保取到目標菌，防止挑取的全部是雜菌而造成假陰性的結果。

3.3 結果分析、處理、報告環節

試驗操作過程的每一步結果均應詳細記錄下來，方便出現問題時查找原因、采取糾正措施。定性檢驗項目要嚴格依據標準規定的鑒定方法進行，不能減少步驟，除了常規的生化鑒定，還應配合對應微生物的特征反應進行染色鏡檢、血清學鑒定、血漿凝固酶試驗、溶血試驗等，綜合多重鑒定結果，確認無誤后報告樣品中檢出或未檢出目標菌。定量檢驗項目中典型菌落計數和確認是關鍵所在，國標中規定的培養時間一般是最長生長時間，試驗中發現很多微生物菌落通常在規定的培養時間之前已能明顯計數，針對這種情況，應隔一段時間觀察菌落的生長情況，并做好記錄，防止過早計數，漏掉生長緩慢的菌落；也要防止過晚計數，避免一些容易蔓延生長的菌落過度生長，相互覆蓋，影響計數結果。

綜上所述，微生物檢測中的每個環節都關系到最終的檢測結果，能力驗證是監控各個實驗環節的有效手段，它能充分暴露實驗室在檢測環節中存在的問題，指導實驗室建立相應的預防措施和糾正措施，維持實驗室的質量體系有效運行。尤其是微生物能力驗證，因其多是陽性樣品，整個試驗操作不但能夠鍛煉和提升檢驗人員的技術能力和水平，而且能夠體現微生物實驗室的檢測能力，是有效實現實驗室質量控制的重要手段。