不同品種柿子的多酚單寧黃酮含量及其抗氧化活性研究

李佳潞，黨 輝，楊夢潔，梁鑫宇，穆明月，劉馨雨，張海生

（陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西西安 710100）

柿子（Diospyros kakiLinn.f.） 屬于柿科（Ebenaceae），柿屬（Diospyros kaki）[1]，原產于中國。中國是世界上生產柿子栽培面積最大的國家，占世界柿子栽培面積的91%，其產量占世界總產量的73%[2]。主要產地分布在山東、陜西、云南、河南、河北等地區[3]，有8 000 多種[4]。柿子根據口味可分為甜柿和澀柿兩大類[5]，我國栽培的柿子主要為澀柿。

柿子含有豐富的維生素、礦物質、還原糖、多糖、纖維素和果酸等營養物質和單寧、黃酮等活性成分，被譽為“果中圣品”。傳統的中醫認為，柿子具有清熱解毒[2]、補虛[6]、健胃、滋養等功能，可以輔助治療高血壓、慢性支氣管炎[2]等疾病，對惡心、眩暈、腫脹[2]等不適癥狀也有一定的效果。現代研究表明，柿子中含有豐富的單寧和黃酮等多酚類物質，具有清除自由基[7]、止血、殺菌、免疫調節[8]、預防癌癥、抗突變[9]、使人體血壓維持在正常水平、預防動脈硬化、治療黃褐斑[10]等作用，還具有防曬、美白[7]功效。對13 個品種柿子的多酚、黃酮和單寧的含量、活性進行比較研究，以期為柿子的開發利用提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

MultiskanGo 型全波長酶標儀，美國Thermo 公司產品；L420 型低速離心機，湘儀離心機公司產品；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；BILON-650CT 型多用途恒溫超聲波提取機，西安比朗生物科技有限公司產品；GZX-9146 MBE 型數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備產品；JA2003N 型電子天平，冠森生物科技有限公司產品；HDM-1000C 型數顯恒溫電熱套，常州榮華儀器制造有限公司產品；722 型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品。

1.2 試劑

標準品：單寧酸、沒食子酸（98.5%），AR，上海源業生物科技有限公司提供；蘆丁（95%） BR，上海源業生物科技有限公司提供。

試劑：1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司提供，氫氧化鈉、硝酸鋁、硝酸鋁、硝酸鋁、飽和碳酸鈉、福林-酚試劑和無水乙醇等其他試劑，均為國產分析純。

1.3 材料

1.3.1 澀柿

牛心柿（別名水柿）、四棱柿，采摘于陜西省西安市鄠邑區；五花柿、尖柿，采摘于陜西省咸陽市彬縣；板柿、鏡面柿、君遷子，采摘于陜西省渭南市蒲城縣；金瓶，2018 年10 月23 日采摘于陜西省漢中市華陽鎮；黑柿，采摘于陜西省漢中市西鄉縣；小萼子，采摘于山東省濰坊市臨朐縣。

1.3.2 甜柿

次郎，采摘于陜西省西安市鄠邑區；陽豐、中冒蓋，采摘于陜西省漢中市西鄉縣子午鎮。

2 試驗方法

2.1 柿子多酚和黃酮的提取

參考王燕等人[11]的方法，稍作修改。選取不同品種柿子各5 個，在每個柿子上取樣1.00 g，每個品種的柿子共稱量5.00 g，于研缽中研磨，直至其為糊狀，倒入燒杯中，向燒杯中加入體積分數為50%的乙醇溶液70 mL，加入質量分數為1%的鹽酸溶液1 mL，放入60 ℃恒溫水浴鍋中，提取120 min，過濾，得到濾液，定容至100 mL 容量瓶中，以轉速4 000 r/min 離心6 min，作為多酚和黃酮的待測液。

2.2 柿子單寧的提取

按照崔翠等人[12]的方法，稍作修改。選取不同品種柿子各5 個，在每個柿子上取樣1.00 g，每個品種的柿子共稱量5.00 g，于研缽中研磨，直至其為糊狀，倒入燒杯中，向燒杯中加入體積分數80%的乙醇溶液80 mL，搖一搖。放在水浴鍋中，設定溫度為90 ℃，120 min后取出，涼水沖洗瓶身，冷卻至室溫，將柿子勻漿倒入容量瓶中，定容至100 mL，靜置5 min，取上層清夜，采用離心機以轉速3 000 r/min 離心8 min 后，取上層清夜，作為單寧的待測液。

2.3 柿子抗氧化活性提取液的制備

參考孫興榮等人[3]的方法，采用乙醇提取法，選取不同品種柿子各5 個，在每個柿子上取樣1.00 g，每個品種的柿子共稱量5.00 g，于研缽中研磨，直至其為糊狀，倒入燒杯中，加入體積分數為70%的乙醇溶液80 mL，振蕩搖勻。將勻漿置于水浴鍋中，設置溫度為50 ℃，水浴50 min 后，冷卻至室溫，于100 mL 容量瓶中定容，靜置5 min，取上清液。用離心機離心，以轉速4 000 r/min 離心6 min。然后取上層清夜，作為抗氧化活性的待測液。

2.4 柿子總酚含量的測定

2.4.1 沒食子酸標準曲線繪制

參考陳佳歆[13]的方法，采用標準曲線法，測定13 個樣品中黃酮的含量。精密稱取沒食子酸標準品100 mg，放在燒杯中，加蒸餾水充分溶解，在容量瓶中定容至100 mL，得到1 mg/mL 的標準沒食子酸工作液。依次吸取沒食子酸標準工作液，0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 試管中，加入福林-酚試劑0.5 mL，室溫下黑暗反應5 min；加入質量分數為7.5%碳酸鈉溶液0.4 mL，用蒸餾水定容至10 mL，室溫下黑暗反應60 min 后，于波長765 nm 處測定吸光度A，制作標準曲線，得回歸方程為Y=0.004 2X+0.033 5，R2=0.980 5。

2.4.2 樣品的測定

吸取待測樣品液2 mL，測定方法同標準曲線的沒食子酸。每個樣品進行3 組平行試驗，通過標準曲線計算樣品總酚含量，結果以1 g 干樣品中沒食子酸的質量表示。

2.5 柿子總單寧的測定

2.5.1 FoLin-Denis 試劑的配制

準確稱取鎢酸鈉100.00 g，磷鉬酸20.00 g，用量筒量取50.00 mL 的磷酸，全部加入到750 mL 蒸餾水中，回流2 h 后冷卻至室溫，稀釋定容至1 L。

2.5.2 單寧酸標準曲線繪制

參考李鵬等人[14]的方法。精密稱取單寧酸50.0 mg，放在燒杯中，加蒸餾水溶解，置于容量瓶中，定容至50 mL，搖勻，得質量濃度為1 mg/mL 的標準溶液。分別吸取單寧酸標準溶液，0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 試管中，加入FoLin-Denis 試劑0.5 mL，飽和碳酸鈉溶液1.0 mL；蒸餾水定容至10 mL，搖勻后，置于室內30 min，于波長650 nm處測得吸光度A，制作標準曲線，得回歸方程為Y=0.004 4X+0.015 5，R2=0.988 3。

2.5.3 樣品的測定

將待測樣品稀釋10 倍，吸取1.0 mL 稀釋的樣品液，測定方法同標準曲線的單寧酸。每個樣品進行3組平行試驗，通過標準曲線計算樣品單寧含量，結果以1 g 干樣品中單寧酸的質量表示。

2.6 柿子黃酮含量的測定

2.6.1 蘆丁標準曲線繪制

參考陳佳歆[13]的方法。精確稱取蘆丁標準品0.1 g，燒杯中溶解后，在100 mL 容量瓶中定容，得到蘆丁標準工作液。將蘆丁標準工作液稀釋10 倍，得到質量濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁工作液，依次吸取稀釋10 倍后的蘆丁標準工作液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于10 mL 試管中，加入25 mg/mL 的亞硝酸鈉溶液2.0 mL ，室溫靜置反應6 min；加入質量濃度為50.0 g/mL 的硝酸鋁溶液2.0 mL，室溫靜置6 min；最后加入質量濃度為0.16 g/mL 的氫氧化鈉溶液2 mL，室溫靜置，10 min 后，用蒸餾水定容至10 mL，于波長510 nm 處測定吸光度A，制作標準曲線，得回歸方程為Y= 0.034 6X+0.019 7，R2=0.982 5。

2.6.2 樣品的測定

吸取待測的樣品液0.5 mL，測定方法同標準曲線的蘆丁。每個樣品進行3 組平行試驗，通過標準曲線計算樣品黃酮含量，結果以1 g 干樣品中蘆丁的質量表示。

2.7 柿子提取液DPPH 清除率的測定

2.7.1 DPPH 試劑的配置

參照《多肽抗氧化性測定DPPH 和ABTS 法》（GB/T 39100—2020） 國家標準，配置DPPH 溶液；準確稱取DPPH 5.0 mg，用適量無水乙醇溶解，在30 ℃下，避光超聲處理5 min，完全溶解后取出，定容至100 mL，制備成50.0 μg/mL DPPH 溶液。溶液應現場配制和使用。

2.7.2 預試驗

對于一個樣品，取3 支試管，分別編號為1，2，3；在1 號試管中，加入無水乙醇溶液1.0 mL，DPPH 溶液3mL；在2 號試管中，加入稀釋后的樣品溶液1.0 mL，無水乙醇溶液3.0 mL；在3 號試管中，加入稀釋后樣品溶液1 mL，DPPH 溶液3 mL。

試劑添加好后，充分混合搖勻，室溫下避光反應，30 min 后，于波長517 nm 處測定吸光度，通過1 號試管得到的吸光度記為Ac；通過2 號試管得到的吸光度記為Aj；通過3 號試管得到的吸光度記為Ai；按公式（1） 計算清除率，根據不同樣品的清除率，為每個樣品設置不同樣品的濃度梯度，使每個樣品的清除率都可以通過縱坐標為50%的點。

2.7.3 樣品的測定

根據預設，對每個樣品設置不同濃度梯度，取不同濃度梯度的待測樣品溶液，加無水乙醇至1 mL，加入DPPH 溶液3.0 mL，充分混合均勻后，室溫避光反應30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，記為Ai。

柿子提取液DPPH 清除率按下列公式計算：

式中：Aj——樣品自身的吸光度；

Ac——DPPH 本身吸光度；

Ai——樣品對DPPH 作用后的吸光度。

2.7.4 IC50值的計算

按照任飛[15]的方法，以一個樣品的不同濃度梯度為橫坐標，以DPPH·清除率為縱坐標，做DPPH·清除率的曲線，按照非線性回歸的方法，計算當DPPH·清除率達到50%時的質量濃度。即為IC50值。

3 結果與分析

3.1 13 個柿子品種的總酚含量

13 個柿子品種的總酚含量見圖1。

圖1 13 個柿子品種的總酚含量

由圖1 可知，柿子品種間的總酚含量差異很大，10 個澀柿品種中，君遷子的總酚含量最高，含量為0.163 mg/g，牛心柿的最低，含量為0.125 mg/g；3 個甜柿品種中，次郎的總酚含量最高，含量為0.151 mg/g，陽豐的最低，含量為0.094 mg/g。13 個柿子品種總酚含量由高到低的順序為君遷子＞板柿＞鏡面柿＞四棱柿＞次郎＞小萼子＞黑柿＞金瓶＞尖柿＞五花柿＞牛心柿＞中冒蓋＞陽豐。

3.2 13 個柿子品種的總單寧含量

13 個柿子品種的總單寧含量見圖2。

圖2 13 個柿子品種的總單寧含量

由圖2 可知，柿子品種間單寧含量差異很大，澀柿的單寧含量顯著高于甜柿（p＜0.05）。10 個澀柿品種單寧平均含量為2.182 mg/g，3 個甜柿品種單寧平均含量為0.491 mg/g。10 個澀柿品種中，單寧含量差異也很大，君遷子的單寧含量最高，為4.496 mg/g；金瓶的單寧含量最低，為1.329 mg/g。3 個甜柿品種中，中冒蓋的單寧含量最高，為0.627 mg/g；陽豐的單寧含量最低，為0.42 mg/g。13 個柿子品種的單寧含量由高到低的順序為君遷子＞黑柿＞板柿＞鏡面柿＞四棱柿＞小萼子＞五花柿＞牛心柿＞尖柿＞金瓶＞中冒蓋＞次郎＞陽豐。

3.3 13 個柿子品種的黃酮含量

13 個柿子品種的黃酮含量見圖3。

圖3 13 個柿子品種的黃酮含量

由圖3 可知，柿子不同品種間的黃酮含量差異很大，10 個澀柿中，鏡面柿的黃酮含量最高，為0.96 mg/g，尖柿的含量最低，為0.24 mg/g；3 個甜柿品種中，次郎的黃酮含量最高，為0.28 mg/g；澀柿的黃酮含量高于甜柿，10 個澀柿品種黃酮含量的平均值為0.48 mg/g；3 個甜柿品種黃酮含量的平均值為0.25 mg/g。13 個柿子品種的黃酮含量由高到低的順序為鏡面柿＞黑柿＞四棱柿＞五花柿=板柿＞牛心柿＞君遷子＞小萼子＞金瓶=次郎＞尖柿=中冒蓋=陽豐。

3.4 13 個柿子品種的抗氧化活性

3.4.1 柿子提取液對DPPH 自由基的清除能力

柿子提取液的DPPH 自由基清除率見圖4。

由圖4 可知，柿子不同品種DPPH 自由基的清除能力差異很大，清除能力與濃度呈正相關。13 個品種中，君遷子的DPPH 自由基的清除能力最強，0.5 mg/mL 的清除率為80%；中冒蓋的清除能力最弱，25 mg/mL 的清除率只有68%。澀柿的DPPH 自由基清除能力強于甜柿，這和柿子中的多酚、黃酮和單寧的含量有關，多酚、黃酮和單寧含量高，抗氧化能力強。13 個柿子品種的抗氧化能力由大到小的排列順序為君遷子＞黑柿＞四棱柿＞鏡面柿＞板柿＞牛心柿＞小萼子＞尖柿＞金瓶＞五花柿＞陽豐＞次郎＞中冒蓋。

圖4 柿子提取液的DPPH 自由基清除率

3.4.2 柿子提取液對DPPH 自由基的IC50值

IC50可以表示對自由基清除能力的大小，若IC50值比較小，則該抗氧化劑有很強清除自由基的能力，相應的，其抗氧化能力也越強。

柿子提取液對DPPH 自由基的IC50值見表1。

由表1 可知，君遷子對DPPH 自由基的清除能力最強，其IC50值為0.21 mg/mL；中冒蓋對DPPH自由基的清除能力最弱，其IC50值為17.8 mg/mL。澀柿的IC50值顯著低于甜柿，說明澀柿的抗氧化活性顯著高于甜柿。

表1 柿子提取液對DPPH 自由基的IC50 值/mg·mL-1

4 結論

不同柿子品種的多酚、黃酮、單寧含量和抗氧化活性存在顯著差異，澀柿的總酚、總單寧和總黃酮含量高于甜柿，抗氧化活性強于甜柿。君遷子是13 個柿子品種中總酚和單寧含量、抗氧化活性最高的品種，開發前景好。