反應條件對賴氨酸-殼寡糖美拉德反應產物抗氧化性的影響及其抑菌性研究

文俊仁，盧靜靜，文 靜，孫煒煒

（1. 武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北武漢 430205；2. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北武漢 430050）

0 引言

美拉德反應是一種自然發生于食品加工和儲存過程中的非酶促褐變反應，是食品香味和色澤產生的方式之一，該反應可以使食物得到誘人的色澤、濃郁的芳香和特有的滋味。美拉德反應產生的還原酮、類黑精等雜環化合物會影響食品的顏色、風味及營養價值[1]，研究發現美拉德反應產物（Maillard Reaction Products，MRPs） 還具有抗氧化性、抑菌性等生物活性[2]，同時還能夠延緩機體衰老、幫助清除自由基、抑制癌細胞增殖[3]，對于人體健康和防治疾病有重要意義，可作為新型天然抗氧化劑取代化學合成類抗氧化劑應用于食品中，防止食物變質。

殼寡糖是一種含有游離氨基的堿性多糖，天然無毒副作用，有良好的溶解性、抗氧化性和抗菌活性，還可以降低人體血脂水平，增強免疫力[4-5]；分子中存在大量活性基團，不僅可以和蛋白質發生美拉德反應，也可以與糖發生美拉德反應，優化其生物活性，在食品藥品領域具有廣闊的應用前景。因此，以賴氨酸和殼寡糖為原料制備美拉德反應產物，探究反應溫度、反應時間、反應pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質量比等反應條件對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響，并對優化產物的抑菌性進行研究，旨在為美拉德反應產物在食品防腐劑中的應用提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼寡糖，山東奧康生物科技有限公司提供；賴氨酸，南京都萊生物技術有限公司提供；冰乙酸、無水醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硫酸、TPTZ 等，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

722 型紫外可見分光光度計，天津冠澤科技有限公司產品；AL104 型分析天平，梅特勒—托利多儀器（上海） 有限公司產品；LX-B75L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，成都宜恒實驗儀器有限公司產品；HHS2 型恒溫水浴鍋，鄭州市亞榮儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

（1） 反應溫度對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調節溶液pH 值為8，取10 mL 反應液置于試管中，分別于80，90，100，110，120 ℃條件下恒溫反應90 min，考查反應溫度對美拉德產物褐變程度及抗氧化性的影響。

（2） 反應時間對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調節溶液pH 值為8，取10 mL 反應液到試管中，于100 ℃下分別反應30，60，90，120，150 min，考查反應時間對美拉德產物褐變程度及抗氧化性的影響。

（3） 反應pH 值對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調節溶液pH 值分別為6，7，8，9，10，取10 mL反應液置于試管中，于100 ℃下反應120 min，考查反應pH 值對美拉德產物褐變程度及抗氧化性的影響。

（4） 賴氨酸與殼寡糖摩爾質量比對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖分別以摩爾質量比2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0 稱取適量，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調節溶液pH 值為8，取10 mL 反應液到試管中，在100 ℃下反應120 min，考查反應物質量比對美拉德產物褐變程度及抗氧化性的影響。

1.3.2 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上設計正交試驗，探討不同反應條件對賴氨酸-殼寡糖美拉德反應產物抗氧化性的影響，并篩選出最佳反應條件。

1.3.3 FRAP 測定

參照文獻[6]的方法進行測定。

1.3.4 褐變程度

將反應得到的美拉德反應產物于波長420 nm 處測定吸光度，吸光度越大表示美拉德反應褐變程度越深。

1.3.5 抑菌性

將制備的美拉德反應產物進行梯度稀釋，得到不同濃度的稀釋液。采用牛津杯法通過測定抑菌圈大小，研究美拉德反應產物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

2 結果與分析

2.1 賴氨酸與殼寡糖美拉德反應條件對抗氧化性的影響

2.1.1 反應溫度對美拉德反應產物性質的影響

反應溫度對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響見圖1。

圖1 反應溫度對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖1 可知，隨著反應溫度由80 ℃升高至110 ℃，美拉德反應產物褐變吸光度由0.082 升至0.356，FRAP 值由2.22 升至3.38，溫度升高能夠提高美拉德反應的速率，使體系快速生成大量的還原酮和類黑色素等化合物，使反應產物的褐變程度加深，該類物質具有還原力和金屬離子螯合力[7]，因此FRAP 值增大，抗氧化活性增強；繼續升高反應溫度至130 ℃，產物的褐變程度及抗氧化活性均呈現下降趨勢，可能由于還原酮及類黑素等化合物在過高的溫度下會發生分解，造成抗氧化活性降低。因此，在110 ℃時制備的美拉德反應產物，褐變程度和抗氧化活性最強。

2.1.2 反應時間對美拉德反應產物性質的影響

反應時間對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響見圖2。

圖2 反應時間對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖2 可知，隨著反應時間的延長，美拉德反應產物褐變吸光度及抗氧化性均呈現先增加后減弱的趨勢，在反應時間為120 min 時，褐變及抗氧化活性均達到最大值。可能由于反應時間延長，殼寡糖與賴氨酸經脫氫、縮合、分子重排生成的還原酮及類黑素等化合物逐漸積累增多，產物褐變及抗氧化活性增強，高溫反應時間太長，生成的化合物容易降解減少，造成抗氧化活性降低。因此，反應時間為120 min 時，所得美拉德產物具有最強的抗氧化能力。

2.1.3 反應pH 值對美拉德反應產物性質的影響

反應pH 值對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響見圖3。

圖3 反應pH 值對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖3 可知，隨著反應pH 值的增大，美拉德反應產物的抗氧化性呈先增大后減小的變化趨勢，當反應pH 值從6.0 上升至8.0 時，產物褐變吸光度由0.078 升至0.371，FRAP 值由2.16 升至3.25，褐變程度和抗氧化活性增強，這可能是由于美拉德反應是一種堿催化反應，反應pH 值增大堿性增強，體系中游離氨基的濃度增大[8]，利于類黑素等化合物的生成，抗氧化活性增強；pH 值繼續增大至10，產物褐變程度和抗氧化活性減弱，可能由于賴氨酸等電點pI 為9.74，當反應pH 值大于pI 時，賴氨酸呈陰性，可通過遮蔽正電基團間的相互作用減少氨基酸與多糖的相互作用[9]，生成的類黑素等化合物減少。因此，反應pH 值為8.0 時，褐變程度和抗氧化活性均最大。

2.1.4 賴氨酸與殼寡糖摩爾比對美拉德反應產物性質的影響

反應物摩爾質量比對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響見圖4。

圖4 反應物摩爾質量比對美拉德反應產物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖4 可知，當增加反應體系中殼寡糖含量時，美拉德反應產物的褐變程度及FRAP 值均增大；當n賴氨酸∶n殼寡糖為1∶2 時，產物的FRAP 值最高，抗氧化活性最強，這可能是由于賴氨酸的自由氨基含量較高，當殼寡糖含量較低時，較多的自由氨基處于游離狀態而不能發生反應，適當增加殼寡糖含量，游離羰基增多，更多的氨基參與美拉德反應，生成較多的美拉德反應產物，褐變程度增加。因此，賴氨酸與殼寡糖摩爾質量比為1∶2 時，所得美拉德產物具有最強的抗氧化能力。

2.1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果, 選擇反應時間、反應溫度、反應pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質量比4 個因素的較優水平，按L9（34）設計正交試驗。

正交試驗結果見表1。

表1 正交試驗結果

對以上正交試驗結果進行極差分析可知，4 個反應條件對美拉德反應產物抗氧化性影響的主次順序為B＞A＞C=D，即反應溫度影響最大，其次為反應時間，反應pH 值和賴氨酸與殼寡糖質量比對產物抗氧化性的影響較小。由表1 的值分析可知美拉德反應產物抗氧化性最強的制備條件組合為A3B3C2D1，該組合為試驗9，因此無需驗證試驗，說明在A3B3C2D1條件下反應得到的美拉德反應產物抗氧化性最強，即反應時間150 min，反應溫度120 ℃，反應pH 值8，賴氨酸與殼寡糖質量比= 1∶1，在此條件下反應所得的美拉德反應產物抗氧化性最強，其FRAP 值為4.31。

2.2 美拉德反應產物抑菌性研究

利用上述所得最優反應條件制備美拉德反應產物，利用牛津杯法通過測量抑菌圈直徑對其抑菌性進行研究。

美拉德反應產物稀釋梯度對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的影響見表2。

表2 美拉德反應產物稀釋梯度對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的影響/mm

由表2 可知，賴氨酸與殼寡糖美拉德反應產物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌圈，同濃度下其對枯草芽孢桿菌的抑菌圈較大，金黃色葡萄球菌的抑菌圈次之，對大腸桿菌抑菌圈不明顯。3 種供試菌中，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，說明該美拉德反應產物對革蘭氏陽性菌有抑菌作用，對革蘭氏陰性菌基本無抑菌效果。隨著美拉德反應產物稀釋倍數的增大，其對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力逐漸減弱。當產物稀釋至10-4時，產生的抑菌圈直徑均小于抑菌性判斷標準的（7 mm），說明在此梯度下美拉德產物沒有抑菌性，故最小抑菌濃度為10-4。

3 結論

以賴氨酸和殼寡糖為原料制備美拉德反應產物，通過單因素試驗及正交試驗考查反應溫度、反應時間、反應pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質量比等反應條件對美拉德反應產物褐變程度和抗氧化性的影響，得到美拉德反應的最佳制備條件為反應時間150 min，反應溫度120 ℃，反應pH 值8.0，n賴氨酸∶n殼寡糖=1∶1，在此條件下制備的美拉德反應產物抗氧化性最強，FRAP 值為4.31；該美拉德反應產物對大腸桿菌無抑菌作用，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，且美拉德反應產物溶液的最小抑菌濃度為10-4；說明賴氨酸和殼寡糖美拉德反應產物具有較好的抗氧化性，對革蘭氏陽性菌有一定的抑菌效果，為美拉德反應產物在食品防腐劑中的應用提供一定理論支持。