基于熒光原位雜交技術的全自動病理染色系統結構設計

林成旭 甘 浪 譚鑫平 李雪梅 閆 旺 李 倩 陳 剛廖廣蘭 劉智勇

1.華中科技大學機械科學與工程學院，武漢，430000 2.武漢康錄生物技術股份有限公司，武漢，430000

0 引言

受人口老齡化影響，我國惡性腫瘤的發病率不斷上升[1-2]。2022年國家癌癥中心報道的最新數據顯示，2016年肺癌和乳腺癌分別是我國男性人群和女性人群中發病率最高的癌癥，相較于2010年分別提高了約32%和46%[3-4]。在發病率上升的同時治愈率也在不斷提高，主要原因在于癌癥診斷相關技術的不斷進步，人們能夠更早地發現癌癥病灶，并予以適當的治療[5]。近年來分子細胞遺傳學發展迅速，熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術是一種在分子水平上檢測核酸序列的有效方法，并在乳腺癌[6]、淋巴瘤[7]、膀胱癌[8]診斷、治療與研究等領域有廣泛應用。

FISH實驗的關鍵步驟在于組織樣本預處理、雜交及染色，此過程需要使用多種實驗儀器和試劑，人工實驗操作繁瑣且極易出錯[9]。在雜交階段，根據使用的探針試劑或檢測需求不同，通常需雜交16 h以上[10-11]，人工開展FISH實驗將大量消耗人力物力資源，檢測效率受到了極大的限制。隨著自動化和智能化技術的快速發展，國內外相關研究團隊提出了采用自動化病理染色系統來代替人工。國內團隊多是針對免疫組化技術研發染色設備，如福州邁新生物技術開發有限公司推出的“Titan”、廈門通靈生物醫藥科技有限公司推出的“Aliya”等，而針對FISH技術的自動化染色設備研究尚少。國外最具代表性的團隊有德國Leica、美國BioGenex等，二者推出的自動病理染色儀支持包括FISH技術在內的多種染色技術。但是用戶使用后發現，前者仍為半自動設備，需手動蓋蓋玻片及揭蓋玻片，一定程度上需要人員值守；后者反應倉底部為非密封結構，在使用過程中存在反應倉試劑泄漏、試劑量不準確等問題，導致染色效果不理想。因此，面向FISH技術的自動病理染色系統還存在自動化程度不足、功能不完善等問題。

本研究以全自動病理染色系統的機械結構為研究對象，參考手工FISH實驗的基本流程，分析染色過程所需的基本操作，利用SolidWorks和AutoCAD軟件設計染色系統的機械結構，依托自動化控制系統實現FISH實驗的全自動進行。本設計解決了上述染色系統存在自動化程度不足、染色效果不理想等問題，具有工作效率高、功能集成度高、染色質量好、發展潛力大、適用樣本種類多等優點，顯著減輕了人員勞動強度，實現了我國針對FISH技術的全自動化染色系統從無到有的突破，推動了FISH實驗的標準化和全自動化發展進程，具有重要的臨床應用價值。

1 總體設計

1.1 總體布局

設計研究的一種全自動病理染色系統的機械結構主要由運動模塊、夾具模塊、輔助模塊等部分組成。其中，運動模塊包含多軸操縱臂、試劑加樣器等，夾具模塊包含載玻片夾具、蓋玻片夾具等，輔助模塊包含取樣平臺、電氣控制柜等。三維結構如圖1所示，取樣平臺1是承接系統機械運動及可供用戶操作的平臺，取樣平臺后方的電氣控制柜2中布置了系統控制單元和驅動單元，取樣平臺上方支承了系統核心工作組件多軸操縱臂3，它主要對放置在載玻片夾具4中的病理切片進行滴樣、蓋蓋玻片和揭蓋玻片等操作，待使用的蓋玻片放置在蓋玻片夾具5中，系統工作過程中所需的生物試劑主要由試劑加樣器6添加至病理切片上。

1.取樣平臺 2.電氣控制柜 3.多軸操縱臂 4.載玻片夾具 5.蓋玻片夾具 6.試劑加樣器圖1 總體結構示意圖Fig.1 Overall structure diagram

1.2 工作原理

通過FISH技術處理病理切片有如下11個詳細步驟：烤片、脫蠟、洗滌、通透、水處理、酶消化、脫水、變性、雜交、洗脫和染色，涉及試劑滴加、蓋蓋玻片、揭蓋玻片、載玻片控溫、載玻片干燥等基本操作，本系統需要模擬人工對病理切片的處理，即需實現上述基本操作的機械化和自動化。

試劑滴加可分為大量試劑(如酒精、脫蠟劑、洗滌劑)滴加及微量試劑(如通透劑、探針、熒光染料)滴加，大量試劑由蠕動泵或氣泵快速噴出，微量試劑由微量注射泵精確滴加；待使用的蓋玻片由蓋玻片夾具夾持，多軸操縱臂中的吸盤軸利用真空吸附原理吸取蓋玻片；載玻片溫度由載玻片夾具中的加熱裝置進行控制；載玻片干燥通過升溫和提高空氣流速來實現，將載玻片夾具升溫可提高試劑蒸發速率，氣泵提供高速氣流排空大部分試劑，殘留的少量試劑由風筒吹干。

2 機械結構設計

2.1 運動模塊

2.1.1多軸操縱臂

多軸操縱臂由多個運動軸構成，是本系統的核心部件，它直接對病理切片進行機械化和自動化的操作，主要完成精確定位病理切片、載玻片吹干、移液槍頭提取、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等操作。操縱臂的布局和結構如圖2所示，建立空間笛卡兒坐標系，X軸和Y軸為獨立單軸，Z軸為三復合軸。自動化設備中常用步進電機作為驅動單元，并搭載同步帶或絲杠螺母實現圓周運動向直線運動轉化[12-13]。同步帶具有傳動承載能力高、噪聲低、振動小等優點，絲杠螺母具有傳動精度高、剛性好、微進給性好、結構緊湊等優點。X軸和Y軸采用同步帶和直線導軌滑塊的傳動形式，在滿足使用工況的情況下減小系統噪聲。Z軸運動精度要求較高，且Y軸的懸臂結構限制了Z軸的體積和質量，因此Z軸采用絲杠螺母的傳動形式，在保證傳動精度和微量進給的情況下提高運動軸剛性。

圖2 多軸操縱臂3D結構圖Fig. 2 3D structure diagram of multi axis control arm

X軸安裝在取樣平臺上，帶動Y軸和Z軸組件沿X方向定點運動。該組件除了必要的結構零件外，還承載了若干步進電機、氣泵、注射泵等，整體質量較大，在沿X軸運動的過程中易發生繞Y軸的旋轉，運動誤差較大，因此本設計使用了雙滑塊的單滑動導軌，通過增加X軸方向的支撐點來保證組件運動的精度和平穩性，同時提高X軸承載能力。此外，在X軸兩端設計有行程開關和橡膠限位塊，可實現軟件層面和硬件層面的雙重保護，防止因人為誤觸或機械故障等因素而導致的X軸超程事故。

Y軸采用懸臂梁結構，盡可能為用戶提供一個開放的操作空間。Y軸帶動Z軸組件定向運動，為了平衡Y軸正方向上Z軸組件的載荷，在Y軸負方向一側設計了一個平臺，用于放置氣泵、注射泵、平衡塊等零件。Y軸下端設計了四個噴氣口，噴氣口與氣泵相連，用于反應結束后排空載玻片上的試劑。噴氣口軸線與載玻片夾角約為70°，噴出的壓力空氣將形成氣流屏障，氣流屏障為試劑提供沿Y軸負方向的推動力，當噴氣口緩慢向Y軸負方向移動時，試劑將被推至夾具排水口端，從而將試劑排出夾具，如圖3所示。載玻片與夾具之間殘余的試劑(如脫蠟劑、通透劑、蛋白酶、洗滌液等)可通過多次滴加并浸泡去離子水或無水乙醇去除，最后對夾具適當升溫將水或無水乙醇蒸發即可。

圖3 試劑排空原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of reagent emptying principle

Z軸是復合軸，分為Z1、Z2、Z3三個運動軸，具有功能多、結構簡單緊湊、體積較小、運動精度高等優點。Z1軸主要用于提取和丟棄移液槍頭。本設計統一采用容積為200 μL的槍頭，在滿足正常吸取試劑的前提下，提高Z軸的緊湊性和通用性。提取裝置具有一定錐度，且略大于槍頭錐度。提取槍頭時，提取裝置向槍頭 移動，槍頭錐面受力發生微小彈性形變，提取裝置與槍頭之間通過靜摩擦力鎖緊，同時摩擦面具有一定的氣密性，以保證后續順利抽取微量試劑。丟棄槍頭時，Z1軸移動至丟棄裝置中，丟棄裝置的卡槽將槍頭卡緊，提取裝置沿Z軸負方向移動克服靜摩擦力，實現槍頭的丟棄。Z2軸主要操作蓋玻片，包括抽取蓋玻片、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等。Z2軸的軸端固定有橡膠吸盤，通過吸盤的真空吸附力將蓋玻片吸牢，搭配X軸和Y軸的運動將蓋玻片送至預定的位置，然后氣泵對吸盤充氣釋放蓋玻片，從而完成上述對蓋玻片的操作。為了防止蓋玻片因水浮作用而漂移，本設計的Z2軸可向下移動，使得蓋玻片貼近載玻片，從而抑制蓋玻片的漂移。本系統使用兩種規格蓋玻片(1號：22 mm×22 mm，2號：24 mm×50 mm)。1號蓋玻片主要用于覆蓋探針，探針黏度大且試劑量極少(約10 μL)，蓋玻片幾乎不會發生漂移。2號蓋玻片用于覆蓋樣本區的通透劑，受反應盒尺寸限制，其漂移量不大于2 mm，且因其面積較大，仍能完全覆蓋樣本區。Z3軸主要對載玻片夾具進行操作，其軸端設置有彈性壓頭，壓頭作用在載玻片上，提供一個向下的復位壓力，防止揭蓋玻片后載玻片被抬起而脫離載玻片夾具的加熱表面，影響后續步驟的溫度控制。

2.1.2試劑加樣器

試劑加樣器分為微量試劑加樣器和大量試劑加樣器。本設計中的微量試劑是指一次噴出量小于200 μL的試劑，大量試劑是指一次噴出量大于1 mL的試劑。

受試劑生產規格及使用成本的影響，微量試劑加樣誤差需控制在1 μL以內，因此，微量試劑加樣器選用最大注射量為200 μL且最小分辨力為0.1 μL的微量注射泵。微量注射泵通過管路與Z1軸槍頭提取裝置相連，微量試劑瓶統一放置在取樣平臺上。微量試劑加樣主要步驟為：①Z1軸提取槍頭；②X和Y軸聯動將槍頭移動至試劑瓶上方；③Z1軸將槍頭插入微量試劑瓶；④注射泵動作吸取定量試劑；⑤Z1軸抬起槍頭；⑥X和Y軸聯動將吸有試劑的槍頭移動至加樣區；⑦注射泵排出試劑完成加樣。微量注射泵使得加樣精準可控，多軸聯動使得移動快速準確。

大量試劑加樣器有直接泵出式和間接泵出式兩種。直接泵出式由蠕動泵提供壓力，直接抽取試劑瓶中的試劑。蠕動泵出口通過管路與多軸操縱臂下端的噴液口相連，噴液口對準載玻片上的組織樣本區，蠕動泵旋轉即可將試劑噴射到樣本區，另外在管路中還配置了快速接頭，便于試劑瓶快速拆裝。根據實驗需求，本設計共有六組直接泵出式試劑加樣器。

間接泵出式由氣泵提供壓力，間接擠出密閉容器中的試劑，如圖4所示。壓力氣泵通過進氣口向試劑瓶通入一定量的空氣，當瓶內空氣壓強大于瓶外大氣壓強時，試劑將通過出液口被擠出。間接泵出式要求試劑瓶具有良好的裝配性和氣密性。本設計在試劑瓶口對稱設置了兩個楔形凸起，相對應地在瓶蓋上設置了兩個楔形滑槽，試劑瓶在滑槽內逆時針旋轉30°～60°即可完成裝配，沿相反方向轉動即可完成拆卸，拆裝簡單便捷。氣密性由密封圈來保證，瓶蓋內襯一個特制的環形橡膠密封圈，密封圈的內側面與試劑瓶口外壁相匹配，以實現試劑瓶口的側面密封。相比于頂面密封的方式，側面密封一方面可以防止因3D打印端面不平而造成的密封不良問題，另一方面可以減小楔形凸起與滑槽間的摩擦力，減少零件磨損，延長使用壽命。

(a)加樣原理 (b)剖面結構圖4 間接泵出式試劑加樣器結構示意圖Fig.4 Structure diagram of indirect pump outreagent sampler

2.2 夾具模塊

2.2.1載玻片夾具

為了便于自動化處理病理切片，載玻片在本系統中應具有唯一且確定的位置，可通過設計載玻片夾具來實現。載玻片夾具是對病理切片定位并夾緊的機構，本系統設置了12個載玻片夾具(即12個工位)。載玻片夾具為獨立結構，各工位之間互不干擾，具有溫度可控、無試劑泄漏和操作方便等優點，主要由夾緊頭、反應盒及發熱片等構成，如圖5a所示。

反應盒是載玻片夾具的主體，是本系統發生生物反應的主要場所。反應盒由銅合金或航空鋁合金等具有良好導熱性能的材料機加工而成，其表面涂鍍一層聚四氟乙烯，以提高反應盒的耐腐蝕性，同時保證其良好的導熱性。反應盒底部貼有電阻或半導體發熱片，用于達到不同反應步驟所需的溫度條件，其控溫精度為0.1 ℃。反應盒底部完全密封，無試劑泄漏問題，能長時間保存反應試劑，保證反應持續進行。病理切片放置在反應盒內，它在X方向和Y方向上的位置精度應小于0.5 mm，通過控制反應盒內側特征尺寸的精度即可保證。

(a)3D示意圖

夾緊頭用于病理切片的夾緊，圖5b為夾緊頭結構示意圖。夾緊頭基體上開有通孔，夾緊按鍵可在其內上下滑動，按鍵上端通過復位彈簧與基體相連。夾緊按鍵外部開有環形槽，基體側面開有水平槽，環形槽與解鎖按鍵的頭部相匹配，解鎖按鍵可在基體水平槽內滑動。夾緊按鍵內部開有階梯孔，壓頭可在其內上下滑動。壓頭下端壓裝了壓片，二者之間為過盈配合，壓片可以減小壓強且防止復位時按鍵飛出。壓片與病理切片直接接觸，傳遞夾緊力。壓頭上端通過夾緊彈簧與堵頭相連，調節堵頭旋入的深度即可調節夾緊力。當夾緊按鍵被按下時，解鎖按鍵在壓縮彈簧的作用下卡入滑槽內，限制夾緊按鍵復位，復位彈簧和夾緊彈簧均被壓縮，達到夾緊的目的。當解鎖按鍵按下時，頭部移出滑槽，夾緊按鍵在復位彈簧和夾緊彈簧的作用下向上彈起，達到松開的目的。本設計為一鍵夾緊及一鍵松開結構，操作方便快捷。夾緊力由壓縮彈簧提供，恒定且可調。

2.2.2蓋玻片夾具

蓋玻片的定位和夾緊通過蓋玻片夾具來實現，兩種規格的蓋玻片所使用的夾具結構相同，僅尺寸不同，夾具結構如圖6所示。夾具體通過底部螺釘與取樣平臺相連，具有確定的位置。夾具體底部開有導向孔，推桿可在孔中上下移動。推桿上端連接推板，蓋玻片被整齊地碼放在推板上，在彈簧的作用下，推板產生一個向上的推力，使得最上方的蓋玻片始終貼緊頂部限位塊，保證抽取蓋玻片的位置一致。頂部限位塊在靠近抽片方向開有一窄縫，控制窄縫寬度，使得最多允許一片蓋玻片通過。抽片時吸盤吸緊最上方的蓋玻片，吸盤移動時蓋玻片與窄縫會產生相互作用，分離多余蓋玻片，并抽取出一片蓋玻片。蓋玻片極薄(0.19～0.23 mm)，而系統工作腔內濕度往往大于70% RH(相對濕度)，普通蓋玻片放置在夾具內極易發生吸潮粘連。蓋玻片粘連后，在通過窄縫時往往會發生蓋玻片與吸盤滑移、一次抽取兩張蓋玻片、蓋玻片無法通過、蓋玻片碎裂等異常情況，從而導致抽取失敗。本設計采用了一種表面帶涂層的防粘蓋玻片，其表面涂覆了疏水材料，在工作腔內幾乎不發生粘連，抽片成功率大于99%。本蓋玻片夾具具有結構簡單、抽片成功率高、操作方便等優點。

圖6 蓋玻片夾具結構示意圖Fig.6 Structural diagram of cover glass holder

在通透、變性、雜交等反應過程中，需使用微量試劑，且需要加熱病理切片。升高溫度會加速試劑水分蒸發，使得試劑濃度發生較大變化，甚至出現病理切片烤干的現象，從而影響反應正常進行，導致最終處理效果不佳。因此，在上述過程中需要在樣本區蓋上蓋玻片，減少水分蒸發。在通透過程中，反應所需溫度高(高于80 ℃)，需進一步采用礦物油密封，在滴加完通透劑后Z1軸更換槍頭并吸取120 μL礦物油，沿載玻片外側白色方框繪制連續油路，隨后采用2號蓋玻片覆蓋，實現密封樣本，維持反應正常進行。而對于大量試劑(如乙醇、脫蠟劑等)，其用量大且反應時間短，故不需要蓋玻片密封。

2.3 輔助模塊

取樣平臺是輔助模塊的主要部件，它主要起到存儲和連接的作用。取樣平臺上存放了待處理的病理切片、染色過程所需的移液槍頭、蓋玻片及微量試劑等，連接了多軸操縱臂、電氣控制柜等，因此在臺面上對應留有相應的安裝位置和連接法蘭。染色過程中，為防止試劑交叉污染，使用過的移液槍頭及蓋玻片需及時丟棄，因此在取樣平臺上分別設計有對應的丟棄孔位，實驗產生的廢液經平臺右側的廢液孔流至廢液桶內，并在實驗結束后分類處置。

電氣控制柜主要用于電能分配和電路保護。電氣控制柜中主要包括加熱控制箱、系統控制板、電機驅動器、信號處理單元和電源適配器等。加熱控制箱實現對12個載玻片夾具獨立控溫。系統控制板實現對系統工作流程的邏輯控制。電機驅動器用于對系統使用的各軸電機、真空泵和蠕動泵等進行運動控制。信號處理單元用于讀取系統傳感器輸出的信號并做出相應的預處理。電源適配器用于變換及穩定電壓并為整個系統供電，除此之外還配備了短路、過載等保護模塊。根據各模塊的電氣連接屬性，合理布局電氣控制柜，設計了相關的安裝及連接結構。

3 系統測試

通過機械加工、3D打印技術等制作機械結構零件，同時引進部分自動化零部件，結合自動控制技術，裝配及調試各功能模塊，得到圖7所示的全自動病理染色系統樣機。對系統的多軸操縱功能、試劑加樣功能、夾持定位功能等進行測試。多軸操縱臂能夠準確定位操作對象，定位誤差不大于±0.1 mm；Y軸氣嘴往復運動2次即可排空載玻片殘余試劑，5 min內即可烘干載玻片；Z1軸能準確提取及丟棄移液槍頭，準確率大于99.5%；Z2軸抽取蓋玻片成功率大于99%，并能完成蓋蓋玻片和揭蓋玻片的動作。試劑加樣器能夠準確響應所需的試劑類型，微量試劑加樣誤差不大于0.6 μL，大量試劑加樣誤差不大于0.5 mL。載玻片夾具操作便捷，最大控溫110 ℃且控溫誤差不大于±1 ℃。測試結果表明，本系統的各模塊均可正常工作，系統功能滿足設計需求，能夠全自動完成FISH實驗的基本操作。

圖7 全自動病理染色系統樣機Fig.7 Prototype of automatic pathologicalstaining system

利用本系統開展FISH實驗。經過長時間的實驗流程和參數優化，本系統能夠得到良好的染色效果，在熒光顯微鏡下可判讀率超過90%。選用合適的組織樣本和生物試劑(如通透劑、蛋白酶、快速探針等)，實驗所需試劑均由武漢康錄生物技術股份有限公司提供。在表1所示條件下完成FISH實驗，使用100倍熒光顯微鏡得到圖8所示的結果，可以看出，本系統處理的病理切片熒光圖像對比度高、信號點清晰可見、酶消化程度良好、熒光染色均勻，滿足病理判讀要求。

表1 關鍵實驗步驟及其條件

(a)紅色熒光圖 (b)綠色熒光圖

將本系統與現有自動化染色系統的部分功能進行比較，如表2所示，可以看出，本系統在機械尺寸、反應倉溫度控制范圍、試劑保持效果和自動化程度上有明顯優勢。除此之外，本系統還能對細胞和尿液樣本進行染色，更換控制程序及對應試劑等參數后亦可用于免疫組化實驗。

表2 本系統與現有染色系統功能對比

4 結語

本研究針對現有染色系統存在的不足，參考人工熒光原位雜交(FISH)實驗的操作過程，設計優化了相關的機械化操作結構：首先，設計了機械運動模塊，模擬人工實驗的相關動作，可實現試劑滴加、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等功能；其次，設計了夾具模塊，可實現載玻片和蓋玻片準確定位、載玻片控溫及干燥、分離蓋玻片等功能；最后，設計了輔助模塊，可實現物品存儲、模塊連接、控制系統保護等功能。裝配并調試優化各功能模塊，搭載自動控制系統，實現了FISH實驗的全自動進行。實驗結果表明，本系統滴樣誤差小于1 μL、定位誤差不大于±0.1 mm、載玻片溫度控制誤差不大于±1 ℃、抽取蓋玻片成功率大于99%、無試劑泄漏，可實現高效全自動病理切片處理，無需人工干預，最終染色效果良好，可判讀率大于90%，臨床應用和市場發展潛力大。