香豆素-3-羧酸制備實驗的改進與拓展設計

黃言吉，劉斌陽，余敏，林敏，周金梅,＊，林麗榕,＊

1廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005

2廈門大學化學國家級實驗教學示范中心，福建 廈門 361005

香豆素是鄰羥基肉桂酸的內酯，含有苯并吡喃的基本骨架。香豆素及其衍生物在自然界中廣泛存在并具有許多應用，例如作為抗凝劑、抗氧化劑、熒光探針、抑制劑、抗生素等等，具有廣闊的研究前景[1,2]。Knoevenagel縮合反應是羰基化合物與活性亞甲基化合物的脫水縮合反應，廣泛用于碳碳雙鍵的形成，是合成香豆素骨架的有效方法之一[3]。

香豆素-3-羧酸的制備是一個經典的實驗，國內許多高校實驗教科書均有涉及[4,5]。一般是以水楊醛和丙二酸二乙酯為原料，在哌啶催化下加熱回流2 h，先得到香豆素-3-羧酸乙酯，再經堿水解15 min、酸化后得到香豆素-3-羧酸。該方法須經兩步反應才能得到目標產物，且使用了易制毒、氣味大、腐蝕性強的哌啶為催化劑，不符合綠色化學理念；內容僅包含“制備、分離純化”兩個步驟，缺乏產物應用的相關實驗，對學生科學素養、應用能力與創新能力的培養不夠，難以滿足現代有機化學實驗教學的要求[6-8]。

基于這些問題與要求，我們通過文獻調研發現，用水楊醛和米氏酸為原料，在水相中加熱回流10 h，一步反應可得到香豆素-3-羧酸，產率93%[9]。另有文獻[10]報道，用同樣的方法于75 °C反應2 h，產率84%。我們對文獻報道的反應條件進行探索，發現在90 °C水浴下攪拌反應30 min，產率即可達到82%。通過改變底物，以相似的方法合成了7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸。基于香豆素-3-羧酸與其衍生物的配位性質和熒光性質，設想香豆素-3-羧酸與7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸能夠與稀土離子配位，通過“天線效應”將吸收的能量傳遞給稀土離子，誘導稀土離子的特征熒光[11]。因此，對香豆素-3-羧酸和7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸與Eu3+的能量轉移進行定性分析、定量分析與計算驗證。實驗涵蓋有機化學、配位化學、分析化學、計算化學等多個二級學科知識，具有較強的學科交叉性質，可以培養學生的綜合應用能力與綠色化學理念。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

改進后的實驗反應示意圖如圖1所示。

圖1 反應示意圖

反應機理[12]如圖2所示。

米氏酸的pKa為4.97[13]，具有較強的酸性，在水中可以電離出質子，形成碳負離子。碳負離子進攻水楊醛的羰基，經Knoevenagel縮合反應得到含碳碳雙鍵的中間體，該中間體的羥基氧進攻分子內酯基，消除一分子丙酮并經過質子轉移得到最終產物香豆素-3-羧酸。

圖2 反應機理示意圖

在稀土離子的激發光譜中，其f-f躍遷通常為宇稱禁阻，導致紫外光區消光系數小。有機配體(如芳香羧酸)在紫外光區有較強的吸收，與稀土離子配位可有效傳遞能量，使稀土配合物發射稀土離子的特征熒光。該現象稱為天線效應(稀土敏化發光)[10]。以密度泛函理論(DFT)方法采用B3LYP/6-311+G(d,p)泛函和基組優化香豆素-3-羧酸與7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸的結構至收斂無虛頻，而后采用相同的方法用含時密度泛函理論(TD-DFT)分別計算香豆素-3-羧酸與7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸的激發態能量，找出其最低三重態能級(T1)能量，與Eu3+(5D0)的發射能級能量比較[14]。

1.2 實驗試劑

實驗所用試劑如表1所示。

表1 實驗所用試劑信息

1.3 實驗儀器

實驗所用儀器如表2所示。

表2 實驗所用儀器信息

1.4 實驗步驟

1.4.1 制備部分

1.4.1.1 香豆素-3-羧酸的制備

在25 mL圓底燒瓶中加入0.75 g米氏酸(5.2 mmol)、0.50 mL水楊醛(4.7 mmol)、4 mL水與磁攪拌子，安裝球形冷凝管，于90 °C水浴中攪拌反應30 min，有白色沉淀析出。冷卻至室溫，抽濾，用少量體積比為1 : 1乙醇-水溶液洗滌，干燥。產量0.73 g，產率82%，熔點190-191 °C。

1.4.1.27-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸的制備

在25 mL圓底燒瓶中加入0.75 g米氏酸(5.2 mmol)、0.90 g 4-(二乙氨基)水楊醛(4.7 mmol)、2 mL無水乙醇、2 mL水與磁攪拌子，安裝球形冷凝管，于90 °C水浴中攪拌反應30 min，有橙色沉淀析出。冷卻至室溫，抽濾，用少量體積比為1 : 1乙醇-水溶液洗滌，干燥。產量0.94 g，產率77%，熔點225-226 °C。

1.4.2 性質探索

1.4.2.1 溶液的配制

溶液配制：溶液1 (5 ×10-5mol·L-1EuCl3)；溶液2 (5 ×10-5mol·L-1香豆素-3-羧酸(coumarin-3-carboxylic acid，C3CA))；溶液3 (5 × 10-5mol·L-17-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸(7-(diethylamino)coumarin-3-carboxylic acid，7-DCCA))；溶液4 (1.5 × 10-4mol·L-1C3CA與5 × 10-5mol·L-1EuCl3混合液)；溶液5 (1.5 × 10-4mol·L-17-DCCA與5 × 10-5mol·L-1EuCl3混合液)；以上溶液均使用乙醇配制。

1.4.2.2 熒光定性分析

在365 nm紫外燈下，觀察以上溶液熒光，觀察并記錄現象。

1.4.2.3 熒光定量分析

設置熒光光譜儀儀器參數如下：

Data mode：Fluorescence；Scan time：1200 s；EX WL：365.0 nm；EM WL：365.0-700.0 nm；Delay：0.0 s；EX Slit：2.5 nm；EM Slit：5.0 nm；PMT Voltage：700 V；Response：0.002 s。

移取3.0 mL混合液于熒光池中，測量光強隨波長變化的曲線。測量完畢后保存，并用Origin軟件處理數據。

1.4.2.4 計算化學驗證

分子結構初始模型可以在英國劍橋晶體結構數據庫(https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/)下載cif文件，也可以用Chemdraw創建分子結構，用Chem3D運行選擇能量最低的構象后，用Gaussview寫輸入文件。使用Gaussian 09軟件中密度泛函理論B3LYP/6-311+G(d,p)方法優化C3CA與7-DCCA在乙醇溶劑中的結構。溶劑模型使用軟件默認的連續極化介質模型(PCM)，同時計算它們的頻率，至收斂無虛頻可確定結構處于最低能量；用含時密度泛函理論采用相同的泛函和基組分別計算二者在乙醇溶劑中前50個激發態的能量，找出最低第一激發單重態(S1)與第一激發三重態(T1)能級的能量，并與Eu3+離子的5D0能級能量進行對比。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

我們在文獻[9,10]的基礎上對反應條件進行探索，結果見表3。從表3可以看出，水浴溫度固定90 °C，隨反應時間增加，產率明顯提高，30 min即可達到82%。再延長反應時間，產率提高不明顯，因此以反應30 min為宜；反應時間固定30 min，溫度過低，反應無法進行；當水浴溫度升至60 °C時，反應速度明顯加快，并且隨著反應溫度的升高產率明顯提高。綜合考慮，我們認為合成香豆素-3-羧酸比較適宜的條件是以水楊醛和米氏酸為原料，水為溶劑，90 °C水浴中攪拌反應30 min。

另外通過改變底物，以相似的方法合成了7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸，產率77%。

表3 反應條件優化

2.2 光譜表征

C3CA：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 12.24 (bs, 1H), 8.95 (s, 1H), 7.85-7.72 (m, 2H), 7.55-7.43(m, 2H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 164.22, 162.53, 154.72, 151.63, 135.90, 130.64, 126.40, 118.61,117.35, 115.04。FT-IR (KBr, cm-1)：3421 (m, O―H), 3056 (w, ArH), 2928, 2780 (C―H), 1744, 1683 (s,C＝O), 1609, 1568 (s, C＝C), 1420 (s, C―O), 1373 (m, C―C), 882, 831, 801, 770 (m, Ph-H)。

7-DCCA：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ 12.50 (bs, 1H), 8.57 (s, 1H), 7.62 (d, J = 9.0 Hz, 1H),6.78 (dd, J = 9.0 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.47 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 1.13 (t, J = 4.0 Hz,6H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 164.46, 159.58, 157.86, 152.89, 149.41, 131.82, 110.03, 107.37,107.11, 95.90, 44.38, 12.29。FT-IR (KBr, cm-1)：3450 (m, O―H), 3096 (w, ArH), 2976, 2936 (C―H),1737, 1665 (s, C＝O), 1619, 1577, 1513 (s, C＝C), 1450 (s, C―O), 1404, 1266 (m, C―C), 830, 804, 774(m, Ph―H)。

2.3 熒光定性分析

在365 nm紫外燈下，溶液1基本不發光、溶液2呈藍紫光、溶液3呈藍光、溶液4呈紅光、溶液5呈黃綠色光，如圖3所示。

圖3 5種溶液在365 nm紫外光下的發射情況

2.4 熒光定量分析

固定Eu3+的濃度為5 × 10-5mol·L-1，改變C3CA與7-DCCA的濃度，得到的發射曲線如圖4所示。隨著體系中C3CA與7-DCCA濃度的增加，發射強度均顯著增大。在C3CA與Eu3+的混合溶液中，在590 nm與615 nm處出現了明顯的Eu3+5D0→7F1、5D0→7F2特征發射峰，表明C3CA可以與Eu3+發生有效的能量轉移。而7-DCCA與Eu3+的混合溶液中，沒有出現Eu3+的特征發射峰，僅出現配體7-DCCA因稀土離子配位作用而紅移的發射峰，表明7-DCCA難以與Eu3+發生有效的能量轉移。

2.5 計算化學驗證

根據TD-DFT的B3LYP/6-311+G(d,p)計算結果，C3CA在乙醇溶液中的最低三重態能級(T1)為22156 cm-1，高于Eu3+(17286 cm-1)的發射能級(5D0)，其能級差為4870 cm-1，處于稀土離子最佳天線效應配體的能級差值內(2500-5000 cm-1)，因此C3CA可以有效傳遞能量，敏化Eu3+發光，使溶液4在590 nm和615 nm處分別發射出Eu3+的5D0→7F1和5D0→7F2的熒光。由于C3CA不能發生完全的能量轉移，在410 nm處仍殘留部分熒光發射，因此溶液的實際顏色為混合后“品紅”色的熒光[14]。而7-DCCA的最低三重態能級(T1)為17691 cm-1，與Eu3+發射能級能量幾乎相等，因此難以發生有效的能量轉移，且7-DCCA與稀土離子的配位導致其發射波長發生紅移，因此溶液5只發射7-DCCA的熒光。

圖4 C3CA (左)和7-DCCA (右)與Eu3+的混合溶液在365 nm紫外光下的發射情況

圖5 C3CA、7-DCCA與Eu3+能級比較示意圖

3 結語

我們對香豆素-3-羧酸的制備實驗進行了改進和拓展：用米氏酸代替丙二酸二乙酯，以水為溶劑，反應時間短、步驟少，無需使用哌啶，符合綠色化學理念；探究制備香豆素-3-羧酸的最優條件，改變底物實現了7-(二乙氨基)香豆素-3-羧酸的合成；多色熒光現象直觀明了，提高實驗趣味性，激發學生進一步探索的興趣；綜合配位與熒光性質，培養學生知識綜合運用能力。可以根據學時、學生實驗能力以及學校所具有的設備條件，對實驗內容進行調整。例如，只安排制備實驗與可視化熒光定性分析，即可在4學時內完成相關內容；有條件的學校可以再增加熒光定量分析，計算驗證可以安排在課外自行完成，即可在12學時內完成實驗。

本實驗涉及Knoevenagel縮合反應、羰基α-H酸性、稀土元素化學、熒光性質等多個不同學科的重要知識點，內容具有創新性、設計性、綜合性，具有很好的教學意義；通過教師引導學生學習、思考、探究，改變傳統“照方抓藥”的教學方式；實驗模塊性強，教師可根據實際需要選擇組合，既可以作為基礎有機化學實驗，也可以作為基礎型綜合化學實驗，適合各層次、各專業學生的本科實驗教學；制備與定性分析不需要昂貴的藥品、復雜的儀器設備與繁瑣的操作，具有較強的教學可行性與較高的推廣價值。

致謝：感謝廈門大學化學化工學院任艷平教授、張慧君教授等老師和廈門大學化學國家級實驗教學示范中心技術人員的幫助和指導。