達(dá)烏里芯芭質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)方法研究

白碩雅 王秀梅 娜布其 其樂(lè)木格 辛 穎 王青虎

內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

達(dá)烏里芯芭CymbariadahuricaL.為玄參科芯芭屬多年生草本植物，分布于中國(guó)黑龍江、內(nèi)蒙古、河北等省區(qū)。其味微苦，性涼，具有燥 “希日烏素”，清熱、止痛、止癢、消腫、止血等功效，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、黃水瘡、皮膚瘙癢、陰囊瘙癢、陰道瘙癢癥、腫塊、外傷出血等癥[1-2]。文獻(xiàn)[3-7]報(bào)道達(dá)烏里芯芭主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜及其苷、苯丙素苷、黃酮類、單萜、倍半萜及有機(jī)酸等。對(duì)達(dá)烏里芯芭質(zhì)量控制方面進(jìn)行研究，劉淑貞等[8]以木犀草素為對(duì)照品，采用TLC法建立了芯芭的真?zhèn)舞b別方法，鄔國(guó)棟等[9]以C8柱為固定相，以0.1%磷酸水-甲醇(99∶1)流動(dòng)相，采用高效液相色譜法測(cè)定芯芭中梓醇的含量，烏仁曹布道等[10]采用高效液相色譜法建立芯芭中6個(gè)環(huán)烯醚萜苷的含量測(cè)定方法，但按藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系向多指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)發(fā)展要求，現(xiàn)已建立的達(dá)烏里芯芭質(zhì)量控制方法無(wú)法有效地評(píng)價(jià)達(dá)烏里芯芭的內(nèi)在質(zhì)量。本文擬將按照2020版《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容要求，建立達(dá)烏里芯芭定性定量方法，補(bǔ)充一般檢查項(xiàng)目，為綜合評(píng)價(jià)達(dá)烏里芯芭的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (Agilent 1260 Quat Pump VL輸液泵，1260 DAD WR檢測(cè)器，LC OpenLab CDS 2工作站，1260 MCT柱溫箱)；AUW220D型電子天平(日本島津)；超聲KQ-600DB型波沖洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；納氏比色管(天津市奧淇洛譜商貿(mào)有限公司)；砷鹽檢查裝置(泰州市康之達(dá)實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；水分測(cè)定儀(北京若水合科技有限公司)。

1.2 材料 硅膠G(上海海洋化工廠)；標(biāo)準(zhǔn)砷溶液(100 μg/mL，批號(hào)：20200720，北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院)；甲醇、乙腈(Fisher Scientific Inc, United States)；超純水為自制；其它試劑均為分析純。對(duì)照品：梓醇、桃葉珊瑚苷、8-表番木鱉和益母草苷均為自制，純度均大于98%以上。不同批次達(dá)烏里芯芭采集信息見(jiàn)表1，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院藥用植物鑒定教研室紅艷副教授鑒定均為正品。

表1 達(dá)烏里芯芭采集信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 樣品液制備 稱取12批樣品粉末各2.0 g，放入錐形瓶(50 mL)中，加二氯甲烷(20 mL)，用超聲波清洗器處理30 min，過(guò)濾，藥渣自然晾干后加甲醇(20 mL)，超聲波清洗器處理30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至10 mL，即得樣品液。

2.1.2 對(duì)照液制備 稱取益母草苷、梓醇和8-表番木鱉對(duì)照品適量，用甲醇配成10 μg/mL的對(duì)照液。

2.1.3 TLC條件 益母草苷和梓醇∶吸附劑為硅膠G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)為展開(kāi)劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑。8-表番木鱉∶吸附劑為硅膠G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)為展開(kāi)劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑。

2.1.4 TLC展開(kāi)、顯色及分析 吸取12批樣品液20 μL和對(duì)照液8 μL點(diǎn)于同一硅膠板(長(zhǎng)和寬為20 cm×10 cm, 厚度為2 mm)上，展開(kāi)，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液顯色，結(jié)果如圖1～3所示。從圖1～3可知，在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的薄層色譜條件下，供試液中與益母草苷、梓醇和8-表番木鱉對(duì)照品Rf值相同斑點(diǎn)存在，并其Rf值合理、斑點(diǎn)清晰、重現(xiàn)性好。

S.對(duì)照液；1～12.樣品液圖1 益母草苷的TLC圖

S.對(duì)照液；1～12.樣品液圖2 梓醇的TLC圖

S.對(duì)照液；1～12.樣品液圖3 8-表番木鱉的TLC圖

2.2 一般檢查

2.2.1 重金屬檢查

2.2.1.1 供試液制備 按2020版中國(guó)藥典有機(jī)破壞-硫代乙酰胺法項(xiàng)下，取本品粉末4.00 g，重金屬檢查要求處理，制備供試液。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液制備 按有機(jī)破壞-硫代乙酰胺法要求，制備標(biāo)準(zhǔn)鉛貯備液。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用標(biāo)準(zhǔn)鉛貯備液配成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液。

2.2.1.3 檢查方法 分別吸取12批供試液和標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液2.0 mL，放入納氏比色管中，依有機(jī)破壞-硫代乙酰胺法項(xiàng)下進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示供試液產(chǎn)生的顏色均淺于標(biāo)準(zhǔn)液，說(shuō)明符合中國(guó)藥典的要求(含重金屬不得過(guò)10 mg/kg)。

2.2.2 砷鹽檢查

2.2.2.1 供試液制備 按2020年版《中國(guó)藥典》古蔡氏法項(xiàng)下，取本品4.0 g，按古蔡氏法要求進(jìn)行有機(jī)破壞并制備供試液。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)砷溶液制備 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將標(biāo)準(zhǔn)砷溶液稀釋成濃度為1.0 μg/mL。

2.2.2.3 檢查方法 吸取12批供試液各12.5 mL和標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液(1.0 μg/mL)2 mL，放入A瓶中，依古蔡氏法進(jìn)行檢查，結(jié)果(如圖4所示)顯示12批供試液產(chǎn)生斑點(diǎn)的顏色均淺于標(biāo)準(zhǔn)液，說(shuō)明符合中國(guó)藥典的要求(含砷量不得過(guò)10 mg/kg)。

S.標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液；1～12.供試液圖4 砷鹽檢查結(jié)果圖

2.2.3 水分測(cè)定 按2020年版《中國(guó)藥典》甲苯法水分測(cè)定要求，分別稱取12批供試品20.0 g，置于圓底燒瓶中，加甲苯適量，連接好水分測(cè)定裝置，加熱10 h，冷卻分層后讀出水分體積，計(jì)算其水分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示，12批供試品中水分含量變化在4.96 %～6.97 %。

表2 12批樣品中水分、灰分及浸出物測(cè)定結(jié)果 (n=3)

2.2.4 灰分測(cè)定 稱取12批供試品適量，經(jīng)馬弗爐有機(jī)破壞，按2020年版《中國(guó)藥典》灰分檢查項(xiàng)下進(jìn)行總灰分與酸不溶性灰分的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示，12批供試品中灰分量變化在8.36%～13.10 %，而酸不溶灰分在1.16%～ 9.01%。

2.2.5 浸出物檢查 按2020年版《中國(guó)藥典》熱浸法項(xiàng)下要求，用水、乙醇作為溶劑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示，12批供試品中水溶性浸出物含量變化在24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 樣品液制備 12批次達(dá)烏里芯芭藥材粉末(過(guò) 60 目篩)各1.0 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶(50 mL)中，加20 mL甲醇，超聲 30 min，過(guò)濾，濾液上加入活性炭1.0 g，放置2 h，過(guò)濾，濾液用 0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，即得供試液。

2.3.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱取梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對(duì)照品各10 mg，分別加甲醇10 mL配成1.00 mg/mL的梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min。在上述色譜條件下，梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離度(R)大于1.5，達(dá)到基線分離效果，理論塔板數(shù)(n)均不低于7000，其HPLC圖(如圖5所示)。

A.樣品液；B.混合對(duì)照液；R1.梓醇；R2.桃葉珊瑚阿苷；R3.益母草苷?qǐng)D5 樣品液和混合對(duì)照液HPLC圖譜

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪畫及檢測(cè)范圍確定 利用微量移液器精密吸取梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別置于量瓶(10 mL)中，用甲醇配成梓醇的濃度為0.50 mg/mL，而桃葉珊瑚阿苷和益母草苷的濃度為0.20 mg/mL，在“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量分別為2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL，計(jì)算其回歸方程式。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系結(jié)果

2.3.4 精密度試驗(yàn) 在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對(duì)照品溶液6次，計(jì)算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，分別為0.61%、0.72% 和0.59 %，表明儀器精密度較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 用液相進(jìn)樣針吸取同一供試品溶液(TZ1)10 μL，在上述色譜條件下，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，計(jì)算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷相對(duì)含量的RSD，分別為1.2 %、0.76%和1.3 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一供試品(TZ1)6份，每份1.0 g，精密稱定，照“2.3.1.1”項(xiàng)下制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷相對(duì)含量的RSD分別1.4 %、1.2 %和1.5 %。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品(TZ1)0.50 g，共 6 份，精密稱定，按樣品中原有量與對(duì)照品加入量的比例為1∶1的要求分別加入梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對(duì)照品適量，按“2.3.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.8 樣品測(cè)定 取 10批樣品各適量，分別按“2.3.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g，n=3)

3 討論

薄層色譜鑒別時(shí)，石油醚-乙酸乙酯-甲酸，環(huán)己烷-丙酮-甲酸及三氯甲烷-甲醇-甲酸等不同梯度展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)益母草苷、梓醇和8-表番木鱉的影響進(jìn)行了考察。當(dāng)益母草苷和梓醇的展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)、8-表番木鱉的展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)時(shí)，益母草苷、梓醇和8-表番木鱉的的斑點(diǎn)清晰、Rf值合理和分離度好。按2020版中國(guó)藥典各檢查項(xiàng)下要求，開(kāi)展了重金屬檢查、砷鹽檢查、水分測(cè)定、灰分測(cè)定及浸出物檢查等項(xiàng)目。從表2可以看出，12批達(dá)烏里芯芭中重金屬、砷鹽、水分均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。12批達(dá)烏里芯芭中總灰分在4.91%～ 8.36%，而酸不溶灰分在1.16%～8.39%。12批芯芭中水溶性浸出物24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸水及甲醇-磷酸水等二元梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%為流動(dòng)相時(shí)，被檢測(cè)成分梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的分離度效果好，分析時(shí)間合理。分梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在210 nm處均最大吸收。

從表3可以看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的線性關(guān)系(r>0.9993)在較寬的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好。從精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，該方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，RSD均小于2.0 %；從表4看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的平均回收率在96.53 %～97.27 %范圍內(nèi)，RSD也均小于2.0 %。從表5看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷在不同批次達(dá)烏里芯芭中相對(duì)含量變化分別為(10.32±0.13)～(11.81±0.16)、(4.03±0.05)～(4.91±0.07)、(2.54±0.03)～(2.93±0.05)mg/g。

綜述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，建立了達(dá)烏里芯芭的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系，為該藥材的質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)。