張 莉，張博源，陳思樂(lè)，劉 猛，潘威霖，蒲一蕾，惠 明，謝 輝

(1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001； 2.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南鄭州 450001；3.工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001)

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是半知菌亞門病原菌，寄主范圍相當(dāng)廣泛，其菌絲、孢子和菌核都可以侵染多種植物，對(duì)于宿主具有致死性，尤其容易感染瓜類、漿果類和茄果類等果蔬作物，是限制果蔬品質(zhì)和產(chǎn)量提高的重要因素之一[1]。鐮刀菌屬(Fusariumspp.)是一類分布廣泛的真菌，其致病性廣，致病力強(qiáng)，使植物表現(xiàn)出萎蔫、腐爛、壞死等癥狀。張陽(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)，木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和茄腐鐮孢菌均可造成草莓根腐病的發(fā)生[2]。在美洲、歐洲、澳洲和亞洲的部分區(qū)域都發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和腐皮鐮孢菌(F.solani)侵染草莓植株，而引起根腐病的報(bào)道，鐮刀菌屬病原菌已成為防治草莓根腐病中最棘手的病原種類[3]。

目前主要在植物葉面噴灑化學(xué)藥劑防控植物真菌病害，化學(xué)方法抑制病害效果較好，但易使病原菌產(chǎn)生高抗藥性，防治效果逐漸減弱[4]。生物防治主要利用細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物，其新陳代謝產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)、促生物質(zhì)和占據(jù)空間可以抑制病原菌的生長(zhǎng)，因此不宜使病原菌產(chǎn)生耐藥性，不會(huì)造成環(huán)境污染，有利于保持生態(tài)平衡。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、綠針假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和丁香假單胞菌(P.syringae)都能顯著抑制灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)[5-8]。近年來(lái)，研究者分離出許多對(duì)病原真菌具有良好拮抗效果的植物內(nèi)生菌[4]，如從櫻桃中分離得到的內(nèi)生特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis) TY-6[9]，從番茄內(nèi)生菌中篩選出的貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)[10]。熒光假單胞菌(P.fruorescnes)、從枝菌根菌(arbuscular mycorrhiza)、枝芽孢菌屬(Virgibacillus)、白黑鏈霉菌(S.alboniger) 和白刺鏈霉菌(Streptomycesalbospinus)等許多微生物被證實(shí)對(duì)草莓根腐病病原菌和灰霉菌有拮抗作用[11-13]。

植物內(nèi)生菌是從健康植株中分離出來(lái)的菌株，在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不對(duì)宿主產(chǎn)生明顯的病害，而且可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，可以與植物病原體進(jìn)行相互競(jìng)爭(zhēng)獲得一種有利于自身發(fā)展和繁殖的因子，從而提高植物宿主對(duì)于這些病原體的抵御能力，是很有潛力的生物預(yù)防資源[14]。目前，對(duì)于植物內(nèi)生菌拮抗灰霉病病菌和根腐病病菌的研究已有報(bào)道[6-7]，但拮抗灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌的草莓內(nèi)生菌鮮見報(bào)道。本研究從草莓植株中分離出內(nèi)生菌，篩選出對(duì)灰葡萄孢菌具有良好抑制拮抗效果的菌株，并對(duì)抑菌效果進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 草莓內(nèi)生菌從草莓健康植株上分離獲得；草莓灰葡萄孢菌從草莓果實(shí)上分離獲得，腐皮鐮刀菌從發(fā)病草莓植株根部分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基，均在121 ℃條件下高壓滅菌20 min后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的形態(tài)觀察 將草莓內(nèi)生菌采用平板劃線法在LB固體培養(yǎng)基上得單菌落，觀察記錄在培養(yǎng)基平板上的生長(zhǎng)狀況、菌落顏色及特征。培養(yǎng) 3～5 d后，進(jìn)行細(xì)菌革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)、大小和顏色，從而初步對(duì)拮抗菌進(jìn)行分類。

1.2.2 灰葡萄孢菌孢子懸液的制備 將灰葡萄孢菌接入PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，取菌絲和孢子放入無(wú)菌水中，過(guò)濾去除菌絲，制備孢子懸液，采用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整懸液中孢子濃度為107CFU/mL，分裝備用[15]。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的篩選與拮抗能力的測(cè)定

1.2.3.1 拮抗細(xì)菌的篩選 以灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌為靶標(biāo)真菌，采用傳統(tǒng)的三點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法，挑取PDA平板上擴(kuò)大培養(yǎng)的病原菌的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基正中間，在距中心等距離處接種待篩選的菌株，以無(wú)菌水作為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，觀察內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制情況，每個(gè)菌種重復(fù) 2～3次。

1.2.3.2 拮抗菌株的拮抗性能測(cè)定 采用兩點(diǎn)平板對(duì)峙法，對(duì)初篩有效果的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩。在直徑為90 mm的裝有PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿背面任意畫2條直徑，在距離圓心2.5 cm的位置接種直徑為 8 mm 的病原菌菌餅，在對(duì)稱的另一側(cè)相同距離處點(diǎn)接細(xì)菌。對(duì)照組在病原菌菌餅的對(duì)稱側(cè)點(diǎn)接無(wú)菌水。28 ℃培養(yǎng) 3～5 d，監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)情況。對(duì)照組真菌菌落邊緣至真菌中心位置的距離為R1；試驗(yàn)組真菌菌落邊緣至真菌中心位置的距離為R2；真菌菌落邊緣至相鄰細(xì)菌菌落邊緣距離為R3，即抑菌半徑。抑菌率按照公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.3.3 拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液的抑菌活性測(cè)定[16]取拮抗菌接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng) 48 h，之后12 000 r/min離心20 min，收集上清液，分別用孔徑為0.22、0.45 μm的濾膜過(guò)濾，得到無(wú)菌發(fā)酵液。用55 ℃左右的PDA培養(yǎng)基把上述發(fā)酵液稀釋10、20倍，之后倒平板。用添加同體積無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。吸取10 mL無(wú)菌發(fā)酵液加入90 mL PDA培養(yǎng)基，每個(gè)平板倒入約25 mL，分4個(gè)平板。培養(yǎng)基凝固后，在中心接入直徑為 8 mm 的灰葡萄孢菌塊，28 ℃恒溫培養(yǎng)。對(duì)照平板菌絲到菌落中心距離為RO，對(duì)不同處理中病原菌的菌落直徑(R1)進(jìn)行測(cè)量。采用公式(2)計(jì)算抑菌率。

(2)

1.2.3.4 拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)孢子活性的影響 萌發(fā)率計(jì)算：孢子懸浮液每隔6 h觀察1次，在12 h后觀察并記錄每個(gè)處理組的孢子懸浮液中孢子的萌發(fā)率，取血球計(jì)數(shù)板，每個(gè)玻片在物鏡40×放大倍數(shù)下，隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，記錄孢子總數(shù)和孢子萌發(fā)數(shù)，孢子萌發(fā)出的菌絲長(zhǎng)度超過(guò)孢子長(zhǎng)度的1/2記為已萌發(fā)。每個(gè)處理組選取的5個(gè)視野的平均值與對(duì)照組106CFU/mL濃度的孢子懸液在所選視野中的孢子萌發(fā)數(shù)與孢子總數(shù)的比值即為該處理組的孢子萌發(fā)率，并根據(jù)公式(3)、公式(4)計(jì)算發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子的萌發(fā)抑制率[17]。

(3)

(4)

1.2.4 16S rRNA的PCR擴(kuò)增和序列分析 選取通用引物16S-27F(5′-A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G-3′)；16S-1492R (5′-G G Y T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、測(cè)序并進(jìn)行同源性比較，利用MEGA X軟件用鄰接法neighbour-joining構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征的鑒定

對(duì)草莓9株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，從菌落形態(tài)可以看出，這9種菌落顏色為白色或乳白色，不透明，圓形，光滑或不規(guī)則，大部分屬于革蘭氏陽(yáng)性桿菌(圖1)，只有菌株AJ-CM321-1屬于革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢，而屬于革蘭氏陽(yáng)性桿菌的除菌株CO-CML21-3外其他菌株均有芽孢(表1)。

表1 9株內(nèi)生拮抗菌形態(tài)及染色特征

2.2 拮抗菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)觀察，擴(kuò)增產(chǎn)物有單一的明亮條帶產(chǎn)生，之后進(jìn)行送樣測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，菌株BS-CM511-2、BS-CMQ121-1、BS-CMQ111-1與枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisDSM 10)在同一分支，同源性達(dá)到99.3%，結(jié)合形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色鑒定結(jié)果可將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

菌株BA-CM11-1與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensNBRC 15535)的序列同源性高達(dá)99.8%，且這2個(gè)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色鑒定結(jié)果，可認(rèn)定內(nèi)生菌BA-CM11-1為解淀粉芽孢桿菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色鑒定結(jié)果可知，菌株BS-CMI41-1和 BP-I11-2與薩夫芽孢桿菌(B.safensis)的同源性分別為99.03%和99.52%；菌株AJ-CM321-1與約翰遜不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)的同源性為99.13%；菌株CO-CML21-3與海洋雙歧桿菌(Curtobacteriumoceanosedimentum)的同源性為89.71%；菌株BM-CMM121-3與巨大芽孢桿菌(Priestiamegaterium)的同源性為99.45%(圖2)。

2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)灰葡萄孢菌及腐皮鐮刀菌的拮抗能力測(cè)定

以病原菌為靶標(biāo)真菌，初篩采用平板三點(diǎn)對(duì)峙法，從上述草莓內(nèi)生菌中初步篩選具有明顯拮抗效果的菌株。進(jìn)一步縮小范圍后，采用平板兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行進(jìn)一步的抑菌效果測(cè)定。結(jié)果表明，在枯草芽孢桿菌BS-CM511-2菌株與灰葡萄孢菌對(duì)峙時(shí)，灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑菌半徑為27 mm，解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1菌株的抑菌半徑為36 mm。解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率為39.95%，枯草芽孢桿菌 BS-CM511-2對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率為57.23%，這2株菌對(duì)腐皮鐮刀菌的抑菌率分別是46.10%和27.20%(表2)。

表2 拮抗菌對(duì)草莓病原真菌的抑菌率

2.3.1 拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)病原真菌的拮抗作用 拮抗菌發(fā)酵48 h的菌液經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾稀釋后加入到PDA培養(yǎng)基中，可以顯著抑制灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)，圖3為稀釋10倍的發(fā)酵液處理前后灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)5 d的情況。與對(duì)照組相比加入了拮抗菌發(fā)酵液處理組，菌絲生長(zhǎng)緩慢，稀薄。在不加拮抗菌發(fā)酵液的對(duì)照組中，灰葡萄孢菌生長(zhǎng)旺盛，菌絲向外擴(kuò)展迅速，培養(yǎng)5 d對(duì)照組中的灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌菌落生長(zhǎng)至半個(gè)培養(yǎng)皿。

圖4、圖5分別為枯草芽孢桿菌BS-CM511-2和解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1無(wú)菌發(fā)酵液稀釋

不同倍數(shù)對(duì)灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌菌落半徑的影響。由圖4、圖5可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各處理菌落半徑均逐漸增加，且培養(yǎng)1.0 d后，稀釋10倍和20倍的枯草芽孢桿菌BS-CM511-2和解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1無(wú)菌發(fā)酵液處理組的病原真菌菌落半徑均顯著小于對(duì)照組。其中稀釋10倍的枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用最大，培養(yǎng)5.0 d灰葡萄孢菌菌落半徑比對(duì)照菌落半徑小20.60 mm。加入稀釋20倍的枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液，灰葡萄孢菌菌落半徑較對(duì)照顯著降低，培養(yǎng)5.0 d比對(duì)照的半徑小17.57 mm。解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1無(wú)菌發(fā)酵液稀釋10倍，對(duì)灰葡萄孢菌也具有顯著抑制效果，培養(yǎng)5.0 d灰葡萄孢菌菌落半徑比對(duì)照小15.64 mm，其抑菌效果與枯草芽孢桿菌BS-CM511-2無(wú)菌發(fā)酵液相比要弱。培養(yǎng)4.0、5.0 d時(shí)，各處理組灰葡萄孢菌菌落半徑表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋10倍<枯草芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋20倍<解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋10倍<解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋20倍<對(duì)照，且差異均達(dá)到顯著水平。添加不同濃度的無(wú)菌發(fā)酵液后，灰葡萄孢菌菌落大小不同，灰葡萄孢菌菌落大小隨發(fā)酵液稀釋倍數(shù)而變化?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵液稀釋10倍對(duì)灰葡萄孢菌抑制效果最好。稀釋10倍的解淀粉芽孢桿菌 BA-CM11-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用最大，培養(yǎng)5.0 d腐皮鐮刀菌菌落半徑比對(duì)照菌落半徑小 8.57 mm。稀釋10倍的枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮刀菌也具有顯著的抑制效果，培養(yǎng)5.0 d腐皮鐮刀菌菌落半徑比對(duì)照小6.47 mm，其抑菌效果與解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1無(wú)菌發(fā)酵液相比要弱。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的相同無(wú)菌發(fā)酵液后，隨發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增大，腐皮鐮刀菌菌落變小，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋10倍對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好。

2.3.2 無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)病原真菌孢子的抑制作用 測(cè)定解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1和枯草芽孢桿菌BS-CM511-2的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響，以不加拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液作為對(duì)照。結(jié)果(表3)表明，培養(yǎng)12 h時(shí)無(wú)菌發(fā)酵液稀釋10倍的條件下解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1對(duì)灰葡萄孢菌孢子的抑制率為81.57%，在相同稀釋倍數(shù)下，枯草芽孢桿菌BS-CM511-2無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于解淀粉芽孢桿菌，為88.80%。相反，枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵濾液處理的灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)率比解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1低7.09%，且差異顯著。解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1和枯草芽孢桿菌BS-CM511-2，在稀釋20倍的情況下對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)均有較高抑制率，但低于稀釋10倍的發(fā)酵液，分別為56.21%和62.83%。因此，枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液比解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1對(duì)灰葡萄孢菌孢子抑制作用強(qiáng)，稀釋10倍的發(fā)酵液比稀釋20倍的發(fā)酵液抑制作用強(qiáng)。解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1和枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液，稀釋5倍較稀釋10倍對(duì)腐皮鐮刀菌孢子的抑制作用強(qiáng)，在相同稀釋倍數(shù)下，枯草芽孢桿菌BS-CM511-2無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮刀菌孢子的抑制率顯著高于解淀粉芽孢桿菌。

表3 無(wú)菌發(fā)酵濾液不同倍數(shù)對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用(12 h)

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生細(xì)菌作為能穩(wěn)定在健康植物組織內(nèi)生長(zhǎng)繁殖且與宿主建立互利互生關(guān)系的一類微生物，并在宿主抵御病原菌的侵染時(shí)進(jìn)行協(xié)助。內(nèi)生菌防治方法利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制植物病原菌的生長(zhǎng)正越來(lái)越多地應(yīng)用于實(shí)踐[18-19]。目前，分析植物內(nèi)生菌的生防效果是通過(guò)大量的分離純化來(lái)鑒定進(jìn)行測(cè)定內(nèi)生菌的抑菌活性，劉超等從金銀花等植物中分離的內(nèi)生菌菌株JS-1對(duì)稻瘟病病菌具有很好的拮抗效果[20]；寧爽分離得到的內(nèi)生假單胞菌BTa14、Bar25可顯著抑制葡萄霜霉病病菌增殖[21]；何藝琴等從小麥中分離出對(duì)赤霉菌具有良好的抑菌效果的內(nèi)生細(xì)菌XG-7[22]；黃瓜的內(nèi)生放線菌對(duì)多種靶標(biāo)真菌都有較高的抑菌活性[23]。本研究從健康草莓植株中篩選得到9株內(nèi)生菌，分別為巨大芽孢桿菌(P.megaterium)、海洋雙歧桿菌(C.oceanosedimentum)、薩夫芽孢桿菌(B.safensis)、約翰遜不動(dòng)桿菌(A.johnsonii)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis) 和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。其中稀釋10倍的枯草芽孢桿菌BS-CM511-2發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用最大，培養(yǎng)5.0 d灰葡萄孢菌菌落半徑比對(duì)照菌落半徑小20.60 mm。枯草芽孢桿菌BS-CM511-2和解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1，2個(gè)菌株的無(wú)菌發(fā)酵液稀釋10倍，對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為88.80%和81.57%，對(duì)灰葡萄孢菌有較好的拮抗效果。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的相同無(wú)菌發(fā)酵液后，隨發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大，腐皮鐮刀菌菌落變小，解淀粉芽孢桿菌BA-CM11-1發(fā)酵液稀釋10倍對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好。本研究篩選得到的這2株內(nèi)生拮抗菌可作為生防資源應(yīng)用于植物灰霉病和根腐病防治，兩者在抑制率上存在差異，其發(fā)酵條件、抗菌物質(zhì)和抑菌機(jī)制等仍需進(jìn)一步研究。