群結腐霉細胞壁降解酶的活性檢測及基因表達分析

陳一帆，薛太強，陳思橋，張金鳳，周冬梅，魏利輝

(1.江蘇大學環境與安全工程學院，江蘇鎮江 212013； 2.江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇南京 210014)

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是一種重要的經濟作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區[1]。中國是世界上生姜栽培面積最大且生產總量最多的國家之一，也是全球生姜出口大國。由群結腐霉(Pythiummyriotylum)侵染引起的生姜莖基腐病，是生姜主要病害之一[2]，對生姜產業造成了巨大的經濟損失[3-4]。該病害在生姜上的癥狀出現在地下根莖部位，表現為水漬狀褐色病變，導致塊莖腐爛、葉片變黃，最終使生姜萎蔫和壞死[5]。群結腐霉在世界各地都有分布，寄主范圍廣泛，除了生姜外還可以侵染花生等多種作物[6]。

植物病原菌按營養攝取方式可分為3種類型：活體營養型、死體營養型和半活體營養型[7]?；铙w營養型病原菌在其整個生命周期內從活的寄主細胞內攝取營養；死體營養型病原菌從死亡(或垂死)的寄主細胞中攝取營養；半活體營養型病原菌最初從活體寄主細胞攝取營養，然后轉變為從死亡的寄主細胞中攝取營養。對3種類型病原菌分泌的植物細胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes，PCWDEs)數量進行比較發現，死體營養型病原菌中的PCWDEs數量最多；其次，半活體營養型病原菌，最少的是活體營養型病原菌[7]。PCWDEs主要包含3種碳水化合物活性酶(CAZymes)，分別是糖苷水解酶(GH)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)[8]。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和結構蛋白組成[9]，是阻止病原菌入侵的主要物理屏障[10-12]。病原菌分泌的大量PCWDEs(如：纖維素酶，果膠酶，蛋白酶和木聚糖酶)可降解不同細胞壁組分，促進其侵染[13]。

纖維素和淀粉是生姜根莖中最主要的2種多糖[14]，其中，纖維素是植物細胞壁的主要成分。病原菌產生的纖維素酶在其侵染植物和定殖的過程中起到重要作用[15]。纖維素酶如β-1，4-葡聚糖水解酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶可降解纖維素生成葡萄糖，協同降解寄主細胞壁[16]。淀粉是植物中最重要的多糖之一，生姜根狀莖中的淀粉含量約11.4%。不同種類的生姜淀粉中的直鏈淀粉所占的比例不同(約占18%～30%)，與馬鈴薯淀粉相似[17]。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等[18]，分解直鏈淀粉后的最終產物以麥芽糖為主，同時還有麥芽三糖及少量葡萄糖。

群結腐霉屬于死體營養型病原菌，基因組中含有大量PCWDEs編碼基因[19-20]，然而目前對這些PCWDEs的功能和特性知之甚少。本研究以群結腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養基上生長的菌絲和環板中的培養液為材料，利用PCWDEs基因功能注釋、轉錄組測序分析和酶活檢測等方法，研究群結腐霉PCWDEs基因表達情況和酶活特征，從而深入探究群結腐霉侵染生姜的致病機制，為該病害的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 本試驗于2021年3月在江蘇省農業科學院中進行，供試菌株群結腐霉SWQ7[21]從山東生姜病樣中分離得到，保藏于江蘇省農業科學院植物保護研究所蔬菜病害防控實驗室。

1.1.2 培養基的配制 V8培養基[21]：V8蔬菜汁340 mL，CaCO33.4 g，5 000 r/min離心10 min后棄沉淀，按1 ∶9的體積比加入蒸餾水，瓊脂1.5%，121 ℃ 滅菌20 min。

Plich液體培養基[22]：KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，(NH4)2SO45 g，L-天冬酰胺 1 g，β-谷甾醇 0.01 g，使用NaOH調pH值至6.0，1 000 mL 超純水，121 ℃滅菌15 min，加入硫胺素0.001 g。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；生姜粉末，山東省萬興食品有限公司；V8蔬菜汁，美國金寶湯公司；0.1 μm孔徑的聚碳酸酯膜，美國GVS過濾技術公司；對硝基苯酚，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；TruSeq Stranded mRNA試劑盒，因美納科學器材有限公司。

1.1.4 主要儀器 單人雙面垂直凈化工作臺，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；恒溫培養箱，上海善治儀器設備有限公司；生物分析儀，安捷倫科技有限公司；酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物細胞壁降解酶類注釋 使用生物學軟件dbCAN2(http：//bcb.unl.edu/dbCAN2/)分析蛋白質是否有CAZy結構域，預測碳水化合物活性酶的基因。利用CAZy網站(http：//www.cazy.org/)[23]，根據CAZy家族或亞家族分類推測含CAZy結構域蛋白的對應活性。PCWDEs指推測活性作用于植物細胞壁多糖組分或植物貯藏多糖的蛋白質，根據推測的活性列出底物。

1.2.2 環板試驗 將群結腐霉SWQ7轉接到含100 μg/mL氨芐青霉素的過濾V8培養基平板上，黑暗條件下于25 ℃培養箱中生長2 d。

本研究中使用一種稱為環板的新型培養技術[24]。在環板的6個環形通道中加入含有 100 μg/mL 氨芐青霉素和適當碳源的Plich液體培養基，將聚碳酸酯膜覆蓋在環板培養皿上，菌株轉接在聚碳酸酯膜上生長，分別使用葡萄糖和生姜粉末作為碳源，制備濃度為1 mol/L葡萄糖原液并使用過濾滅菌，生姜粉末加入Plich培養基后高壓滅菌。環板培養液中的葡萄糖最終濃度為25 mmol/L，生姜粉末的最終濃度為1%。將高溫滅菌的聚碳酸酯膜覆蓋在環板上，在環板中心接種直徑為0.5 cm帶有新鮮菌絲的V8瓊脂塊。25 ℃培養箱中黑暗生長72 h后，分別收集環板中聚碳酸酯膜上的菌絲(用于轉錄組分析)和下方環形通道中培養液(用于酶活檢測)，樣品收集后立即放于液氮中速凍保藏。

1.2.3 RNA提取、RNA-seq文庫制備、測序和數據分析 RNA的提取與純化、RNA-seq文庫制備及轉錄組測序由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。使用Trizol試劑提取樣品中的RNA，在RNA樣品中加入DNA酶去除殘留的DNA。RNA的完整性采用生物分析儀來進行驗證，使用分光光度計測量RNA純度。通過TruSeq Stranded mRNA試劑盒制備2×150 bp的配對文庫，并在Illumina HiSeq X平臺上進行測序。

對原始數據利用Trimmomatic軟件去除接頭序列和低質量序列，獲得高質量有效序列[25]。對處理后的序列采用UseGalaxy.eu中的軟件工具進行下游分析[26]，采用HISAT2 Galaxy將序列映射至SWQ7基因組進行組裝[27](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/108473？genome_assembly_id=1746011)。使用HTSeq-count Galaxy統計所有比對質量 ≥ 10序列，采用聯合模式處理重疊多個特征的序列，在它們映射至所有特征上計算非唯一映射序列[28]。利用DESeq2 Galaxy對計數數據進行基因差異表達分析，其中，默認Cook距離截止值用于異常值過濾[29]。差異表達基因的判定標準為在FPKM(Fragment per kilo bases per million reads)>10的情況下，DESeqPadj<0.05，DESeq log2FC>1或<-1。FPKM值通過表達每Kb基因長度的基因計數和每百萬映射到所有基因的計數計算。

1.2.4 酶活測定 使用連接有對硝基苯酚(pNP)的底物進行酶活測定，在96孔板中加入總體積為100 μL標準測定緩沖液，其中含有Tris-HCl 20 mmol/L (pH值7.5)，連有對硝基苯酚的底物2.5 mmol/L，環板培養液或超純水20 μL。分別配制不同濃度的對硝基苯酚溶液(0、5、10、25、50、80、100、250 nmol/mL)，測定對硝基苯酚溶液在405 nm波長處的數值，以標準品的濃度為橫坐標、測定數值為縱坐標，繪制標準曲線。

在37 ℃反應3～8 h后，加入100 μL濃度為0.25 mol/L Na2CO3溶液終止反應，并使用酶標儀在405 nm波長處檢測對硝基苯酚底物的水解量。酶活單位定義為1 μL培養基溶液1 h產生對硝基苯酚(pNP)的nmol量。本試驗使用對硝基苯酚連接的底物檢測酶活：使用對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷檢測α-葡萄糖苷酶活性；使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷檢測β-葡萄糖苷酶活性；使用對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷檢測β-木糖苷酶活性。連接對硝基苯酚的底物在雙蒸水中制備為50 mmol/L原液。試驗中設置2個技術重復，4個生物學重復，結果使用Student’s T-test檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 群結腐霉植物細胞壁降解酶的分析鑒定

通過生物學軟件dbCAN2和CAZy網站預測分析，由圖1和表1可知，得到群結腐霉中PCWDEs編碼基因共273個，其中，纖維素降解酶有92個、木聚糖降解酶16個、果膠降解酶76個和淀粉降解酶7個。通過與其他已報道的腐霉菌株相比，群結腐霉中PCWDEs數量顯著高于其他腐霉[30-35]；除了貴陽腐霉和寡雄腐霉外，群結腐霉中纖維素降解酶、木聚糖降解酶、果膠降解酶和淀粉酶的數量是其他腐霉菌的2～3倍；值得注意，群結腐霉含有除瓜果腐霉和強雄腐霉以外，還含有其他腐霉菌不具有的木聚糖降解酶。

表1 群結腐霉和其他腐霉菌株中降解特定植物組分的PCWDEs數量

2.2 菌絲在環板上的生長情況

為了解群結腐霉PCWDEs在侵染生姜過程中的基因表達特征和酶活特性，本試驗使用生姜粉末模擬生姜環境，試驗對照選擇最常作為簡單碳源的葡萄糖為對照。由圖2可知，生長72 h后觀察群結腐霉菌絲生長情況，發現群結腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養基上能夠正常生長，但不能穿透聚碳酸酯膜生長至下方培養液中，但生姜粉末培養基中菌絲比葡萄糖培養基中生長得更加致密茂盛。

2.3 轉錄組結果分析

由轉錄組結果(表2)可知，以生姜粉末FPKM值>10，P<0.05，log2FC>1或<-1作為差異表達基因的判定標準發現，與葡萄糖培養基相比，群結腐霉在生姜粉末培養基上生長時有12個PCWDEs基因表達上調，這些基因編碼的PCWDEs中的主要底物為淀粉和纖維素。其中，上調最高的2個基因為Pm_g10935.t1和Pm_g3514.t1，在CAZy家族中屬于糖苷水解酶GH13_32，具有α-淀粉酶活性，其底物為淀粉。

2.4 酶活分析

由于群結腐霉可產生降解淀粉和纖維素的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶以及大量的木聚糖酶，因此，本研究檢測了環板培養基中3種酶活性。由圖3可知，群結腐霉在不同培養基上生長時3種酶活均存在顯著差異，在生姜粉末培養液中α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性顯著高于葡萄糖培養液對照。α-葡萄糖苷酶酶活為0.035 nmol/(h·μL)，較對照高0.030 nmol/(h·μL)；β-葡萄糖苷酶的酶活為0.115 nmol/(h·μL)，較對照高0.080 nmol/(h·μL)；β-木糖苷酶活性為0.025 nmol/(h·μL)，較對照高0.019 nmol/(h·μL)。

表2 群結腐霉在生姜粉末培養基與葡萄糖培養基相比上調表達的PCWDEs基因

3 討論

本研究通過生物學軟件dbCAN2和CAZy網站對群結腐霉PCWDEs基因進行分析和功能注釋，預測了PCWDEs基因編碼的酶和對應的底物。將群結腐霉中的PCWDEs基因與其他腐霉菌株對比發現，群結腐霉中以各種植物組分為底物的降解酶數量均遠大于其他腐霉菌株。不同植物的細胞壁組成存在一定差異，但主要由纖維素、半纖維素、果膠和結構蛋白等多種成分構成，群結腐霉PCWDEs對應多種底物，可協調降解細胞壁[36]，這可能與群結腐霉能侵染多種寄主有關。

轉錄組結果顯示，群結腐霉在生姜培養基中培養，上調的PCWDEs基因有12個，其中，淀粉降解酶的數量最多，其次是纖維素降解酶，這可能與生姜和腐霉細胞壁組成相關。袁甜甜等使用酸水解法測定在去除水分加工后的生姜中淀粉含量為87.8%[37]，Chen等用蒽酮試劑測定出生姜組織樣本粉末中纖維素占生姜根莖中纖維的70%，因此群結腐霉需要分泌大量的淀粉降解酶來破壞生姜組織[38]。此外，腐霉細胞壁的主要成分是2種類型的纖維素微纖維[39]，推測纖維素降解酶數量比淀粉降解酶少的主要原因可能是過高水平的纖維素酶會降解腐霉的細胞壁導致細胞死亡。

利用連有對硝基苯酚底物的酶促反應檢測群結腐霉中的酶活特征，發現生姜粉末培養基的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性均比葡萄糖培養基中的酶活性高。這與轉錄組分析中發現的生姜粉末培養基中纖維素、淀粉和木聚糖為底物基因表達上調的結果一致。Geethu等檢測果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性時，發現它們的活性都隨著群結腐霉的生長而增加[15]。本研究中也檢測了類似活性，但Geethu等在試驗中使用百分數作為各項酶活之間的對比，2個試驗間的數據難以進行比較。然而，群結腐霉在葡萄糖環板上生長時檢測到了所有酶活，這與Geethu等之前檢測時在蔗糖為底物時檢測到纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶的結果[15]相似。

使用環板對群結腐霉的PCWDEs基因進行誘導表達具有一定的局限性，環板試驗中使用的碳源經過高溫滅菌，而在自然條件下植物宿主中的其他因素可誘導群結腐霉產生PCWDEs[40]，在侵染過程中發揮不同的作用，因此后續仍需進一步優化試驗條件。

本研究通過PCWDEs基因功能注釋、轉錄組測序分析和酶活檢測分析，表明淀粉和纖維素對群結腐霉中PCWDEs基因表達有重要作用，其功能分析需要進一步驗證。本研究為后續解析群結腐霉致病機制奠定了基礎，為群結腐霉引起的生姜莖基腐病的防治提供了理論依據。