自噬相關信號通路調控骨相關疾病發生發展的作用機制研究進展

秦慶慶，謝犇 ，王一坤，陽慶林，楊杜斌，王勇平

1 蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000；2 蘭州大學第一醫院骨科

自噬是在各種應激條件下誘導的細胞高度保守的分解代謝過程，可防止細胞損傷并在能量或營養缺乏的情況下促進細胞存活，對各種細胞毒性損傷做出反應，并且可以調控細胞的生長及分化［1］。自噬可通過相關信號通路調控成骨細胞、軟骨細胞、骨髓間充質干細胞（BMSCs）和破骨細胞的增殖、分化等生物學行為，在骨相關疾病的發生發展中發揮重要的調控作用。現就自噬相關信號通路通過調控成骨細胞、軟骨細胞、BMSCs、破骨細胞生物學行為在骨相關疾病發生發展中的作用作一綜述，旨在為骨相關疾病的基礎研究提供借鑒。

1 自噬相關信號通路通過調控成骨細胞生物學行為作用于骨相關疾病發生發展

成骨細胞源自間充質干細胞的單核細胞，在初始骨形成和后期骨重塑期間負責骨的增殖、合成和礦化。成骨細胞通過增殖、分化和礦化三個過程主導骨的形成，該過程受到嚴格調控，若調控異常會導致骨質疏松、骨不愈合等疾病發生。研究表明，自噬可通過磷酸酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR、核因子κB（NF-κB）、Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）等信號通路調控成骨細胞增殖、分化、礦化等生物學行為，在骨相關疾病中發揮關鍵性作用。

1.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路 PI3K/Akt/mTOR是經典自噬信號通路之一，該通路主要由轉導通路PI3K/Akt和效應分子mTOR組成，PI3K分子參與細胞的活性、生長、分化過程，并可調節細胞內蛋白分子的活性。Akt作為PI3K的下游效應分子，位于PI3K/Akt/mTOR信號通路的中間位置，起到承接作用。活化后，磷酸化的Akt分子可以影響下游多個效應分子的活性，從而影響整個細胞周期、蛋白質合成和自噬過程。最下游的效應分子mTOR是Akt的重要底物，可以收到各種信號并做出應答，因此，mTOR在該信號傳導通路中充當“集合點”的作用［2］。研究顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路是自噬抑制通路，該通路激活后可抑制自噬，保護細胞免于凋亡；相反，抑制該通路會誘導自噬并使細胞進入凋亡過程［3］。

TANG等［4］研究發現，雷帕霉素（RAP）和β-蛻皮甾酮均能顯著提高骨折患者成骨細胞堿性磷酸酶（ALP）活性和骨細胞特異轉錄因子RunX2的表達，抑制細胞凋亡率；且可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導成骨細胞自噬，促進骨折愈合。Beclin-1、LC3、p62以及自噬相關基因（ATG）是常用的自噬標志物，YANG等［5］報道，用白藜蘆醇治療骨質疏松大鼠可顯著改善大鼠骨質，降低大鼠血清ALP和骨鈣素水平；此外，在接受大劑量白藜蘆醇治療的骨質疏松癥大鼠中，沉默信息調控因子1（SIRT1）、LC3及Beclin-1表達增加，磷酸化Akt（p-Akt）及p-mTOR下調，提示白藜蘆醇可能通過介導SIRT1和PI3K/Akt/mTOR信號通路增強線粒體自噬，從而保護骨質疏松大鼠的成骨細胞。

1.2 mTOR信號通路 mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶（PIKK）家族，含有mTORC1和mTORC2兩種復合體。RAP敏感的mTORC1能夠通過調控信號通路從而決定細胞的大小；RAP不敏感的mTORC2能夠控制肌動蛋白細胞骨架，從而決定細胞的形狀。mTOR通路受到多種細胞信號的調控，同時也可作為調控其他信號通路的上游分子，參與細胞生長和代謝過程。

WANG等［6］發現知母皂苷BⅡ減弱了糖尿病大鼠脛骨微結構的惡化，并以劑量依賴性的方式減少了大鼠鈣質原發性成骨細胞中高血糖誘導的細胞凋亡，部分恢復了因高糖所致的自噬通量受損；體內結果表明，口服知母皂苷BⅡ下調了糖尿病大鼠近端脛骨中mTOR和NF-κB的磷酸化，上調了Beclin-1的表達。這提示知母皂苷BⅡ可通過抑制mTOR/NF-κB信號通路來減輕高糖誘導的氧化應激和細胞凋亡，從而改善高血糖所致骨質疏松。AL SAEDI等［7］將正常人成骨細胞和RAP放入存在脂毒性濃度的棕櫚酸（PA）培養，發現RAP減少了PA誘導的細胞凋亡，而且自噬體形成顯著增加。WANG等［8］發現分散的納米羥基磷灰石（HAP）以劑量依賴性方式促進成骨細胞分化；內化的納米HAP顆粒位于典型的自噬液泡中，并增加了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例，提示HAP通過mTOR信號通路介導自噬，并以劑量依賴的方式調節成骨細胞的分化。RUOLAN等［9］研究發現，硅酸鹽納米顆粒通過激活mTOR/ULK1誘導自噬，隨后觸發Wnt/β-catenin通路，促進成骨細胞的分化和礦化。

1.3 NF-κB信號通路 NF-κB是一種核轉錄因子，其可與某些基因啟動子區固定的核苷酸序列結合，具有啟動基因轉錄的功能。同時，NF-κB是體內調控細胞的增殖、分化、炎癥過程中的重要轉錄因子，其能夠參與機體的炎癥反應、免疫應答及其他應激反應。XU等［10］通過對照實驗及細胞自噬實驗發現，低濃度脂多糖（LPS）通過NF-κB信號通路激活成骨細胞自噬，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進骨折愈合。QIN等［11］通過檢測LC3蛋白表達及細胞自噬發現，成骨細胞本身具有較強的自噬作用，而適當濃度的SN50對成骨細胞NF-κB通路的阻斷與自噬的明顯抑制有關。ZHENG等［12］采用CCK-8、透射電鏡和流式細胞術評估成骨細胞增殖、自噬和凋亡，發現與正常骨組織比較，股骨頭缺血性壞死（ANFH）骨組織中TNF-α的表達明顯上調，顯著促進了成骨細胞的自噬和凋亡，且p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信號通路被活化；此外，通過抑制劑阻斷該通路，可抑制自噬，促進TNF-α誘導的細胞凋亡。

1.4 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin是一條比較經典的信號通路，β-catenin是檢測Wnt是否激活的一個重要生物標志物。在跨膜受體FZD蛋白家族接收Wnt信號后，可通過下游蛋白激酶的磷酸化作用抑制β-catenin的降解活性，隨后胞質中穩定積累的β-catenin進入細胞核后結合TCF/LEF轉錄因子家族，啟動下游靶基因的轉錄。CHEN等［13］發現TNF-α抑制成骨分化，且下調了LC3Ⅱ、ATG7和Beclin-1的表達，提示自噬在成骨分化過程中受到抑制；Wnt/β-catenin信號通路成員如低密度脂蛋白受體相關蛋白5（LRP5）、β-catenin和磷酸化β-catenin表達也相應降低；此外，TNF-α對成骨分化和Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用可被自噬誘導劑減弱，而自噬抑制劑可加劇該抑制作用。這提示TNF-α通過Wnt/β-catenin信號通路抑制自噬，從而抑制成骨細胞分化，而自噬正向調節Wnt/β -catenin通路。RUOLAN 等［9］研究發現，硅酸鈣（C2SNPs）可顯著促進LC3和Beclin-1的表達，而下調自噬底物P62表達，而這些效應可被自噬抑制劑3-MA部分逆轉；進一步分析發現C2SNPs可以通過抑制mTOR和促進ULK1表達來激活自噬，自噬進一步激活β-catenin表達。這提示C2SNPs可通過激活mTOR/ULK1信號通路誘導自噬，隨后觸發Wnt/β-catenin通路，從而促進成骨細胞的分化和礦化。

2 自噬相關信號通路通過調控軟骨細胞生物學行為作用于骨相關疾病發生發展

軟骨膜細胞通過軟骨內化骨，在生長的軟骨基質中形成軟骨細胞。軟骨細胞的分化成熟過程受到多種信號因子和通路的嚴格調控。研究表明，自噬相關基因在軟骨細胞活性及分化等方面發揮關鍵性的調控作用，同時自噬還可通過相關信號通路來調控軟骨細胞的生物學行為。目前，已知與軟骨細胞自噬相關的信號通路主要集中在PI3K/Akt/mTOR信號通路、AMPK信號通路、NF-κB信號通路、ERK信號通路等。

2.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路 PI3K/Akt信號通路具有促進軟骨細胞增殖并抑制自噬的作用，激活Akt可以通過磷酸化mTOR調節軟骨細胞存活、自噬與凋亡，介導軟骨組織損傷過程。MA等［14］研究發現，氟化鈉（NaF）抑制了小鼠脛骨中增殖細胞核抗原（PCNA）和pS6的蛋白表達并下調小鼠ATDC5軟骨形成細胞系中mTOR信號通路相關基因（PI3K、Akt、mTOR、4EBP1、S6K1）表達；NaF處理后，自噬相關基因LC3、Beclin-1、p62的mRNA和蛋白水平發生顯著變化。MHY1485是一種小分子mTOR激活劑，其可完全逆轉NaF誘導的自噬，且恢復ATDC5細胞中NaF誘導的增殖軟骨細胞標志物Sox9和Ⅱ型膠原蛋白的下調。該研究表明氟化物能夠通過PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制軟骨形成中的增殖并促進自噬，從而導致氟骨癥。XU等［15］通過建立大鼠OA模型發現，SIRT3過表達可抑制IL-1β誘導的炎癥、細胞凋亡、線粒體功能障礙和軟骨細胞變性，而沉默SIRT3可以得到相反的結果；并且SIRT3過表達可以恢復IL-1β誘導的自噬抑制。此外，該研究還發現IL-1β誘導的PI3K/Akt/mTOR信號通路激活被SIRT3過表達抑制，關節內SIRT3過表達減輕了OA誘導的大鼠關節損傷。這提示SIRT3可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活自噬，從而減輕了OA大鼠關節損傷。

2.2 腺苷單磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）/mTOR信號通路 AMPK作為一種重要的生理能量傳感器，是細胞和有機體能量平衡的主要調節因子，協調多種代謝途徑，平衡能量的供需，從而調節細胞和器官的生長。能量代謝平衡調控是由多種相關的信號通路介導的，其中AMPK/mTOR信號通路在細胞內共同構成一個合成代謝和分解代謝過程的開關。同時，AMPK/mTOR也是自噬的重要調控通路，在軟骨細胞的分化、生長和凋亡中起著重要的作用。

MEI等［16］將 ATDC5 軟骨細胞用不同濃度的17β-雌二醇（17β-E2）處理，發現 17β-E2增加了SIRT1、p-AMPK和線粒體自噬相關蛋白的表達水平，但降低了p-mTOR的表達。這表明17β-E2能夠通過SIRT1介導的AMPK/mTOR信號通路誘導線粒體自噬，次那個保護軟骨細胞，可以用于防治絕經后骨關節炎。ZHAO等［17］用IL-1β刺激原代軟骨細胞模擬OA軟骨細胞模型，用臭氧處理后發現，臭氧改善了IL-1β刺激軟骨細胞的細胞活力、抑制了細胞中IL-6和TNF-α的mRNA表達水平并激活AMPK/mTOR信號通路，改善了細胞自噬水平的降低。這提示臭氧可通過激活AMPK/mTOR信號通路，改善IL-1β刺激軟骨細胞自噬水平的降低，抑制炎癥反應，有助于維持細胞的代謝平衡。QIN等［18］研究表明，白藜蘆醇關節內注射部分途徑是通過平衡HIF-1α和HIF-2α的表達，從而調節AMPK/mTOR信號通路，促進軟骨細胞自噬而延緩關節軟骨變性。

2.3 NF-κB信號通路 研究表明，NF-κB能夠調控軟骨細胞的增殖、分化和凋亡，在骨發育和常見的骨疾病中發揮重要作用。LIU等［19］研究發現，RAP可通過激活自噬抑制炎癥分解代謝基因的過表達，并可抑制軟骨細胞內NF-κB信號通路，打破炎癥因子與炎癥因子的正反饋回路，降低炎癥進展速率和水平，延緩炎癥對軟骨的破壞。MI等［20］發現，TNF-α誘導軟骨細胞中IL-1、IL-6、活性氧、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和Caspase-9的產生，抑制自噬標志物ATG5，ATG7的產生，阻止LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ并誘導基質金屬蛋白酶3（MMP-3）及MMP-9表達，而這些影響可以通過淫羊藿苷或NF-κB抑制劑PDTC治療來部分阻斷，提示淫羊藿苷通過抑制NF-κB通路激活軟骨細胞自噬，抑制炎癥細胞因子和細胞凋亡，從而對OA發揮保護作用。JIANG等［21］研究顯示，雙氫青蒿素（DHA）增加軟骨細胞中的LC3-Ⅱ、ATG5水平及自噬體數量，抑制TNF-α誘導的MMP-3、MMP-9表達；TNF-α刺激的核易位、p65和IκBα蛋白的降解分別在DHA處理的軟骨細胞中減弱；而NF-κB抑制激活了TNF-α處理的軟骨細胞自噬。這提示DHA可能通過抑制NF-κB通路促進軟骨細胞自噬，從而抑制軟骨細胞分解代謝和炎癥因子的水平。

2.4 胞外信號調節激酶（ERK）信號通路 ERK包括ERK1及ERK2，參與細胞增殖與分化，是蛋白激酶信號轉導通路家族成員之一，刺激通過ERK信號轉導通路傳至細胞核內，在軟骨細胞的增殖和自噬方面發揮關鍵性作用。

劉敏等［22］研究發現，過表達雌激素受體1（ESR1）能夠促進雌二醇（E2）處理后軟骨細胞LC3及ATG7表達，降低細胞內p-ERK水平；而干擾ESR1表達后，自噬相關蛋白表達減少，凋亡蛋白表達增加，增殖標志基因表達下調，細胞內p-ERK水平相對增加。通過特異性抑制劑阻斷ERK活化，可抑制E2/ESR1誘導的自噬增加及凋亡減少，抑制增殖相關基因表達。這提示E2與ESR1的靶向結合可能通過抑制ERK信號通路的激活促進細胞自噬，誘導細胞凋亡，從而促進體外人軟骨細胞增殖。GE等［23］將小鼠特異性AMPKα雙敲除（AMPKα cDKO）并對小鼠行卵巢切除術（OVX），建立OA模型，發現在OVX AMPK cDKO小鼠關節軟骨中LC3水平降低、p70S6K磷酸化增加，而使用17β-雌二醇刺激可導致LC3轉化率增加、p70S6K磷酸化水平降低；但17β-雌二醇的作用通過阻斷ERK信號通路而被消除，這提示雌激素可通過ERK信號通路促進軟骨細胞自噬，從而保護OA發展過程中的關節軟骨。LI等［24］發現，姜黃素可以增加軟骨細胞中磷酸化細胞ERK1/2、LC3-Ⅱ及Beclin-1的表達，將軟骨細胞與ERK1/2抑制劑U0126共同培養后，自噬標志物的表達降低，提示姜黃可能通過作用于ERK1/2誘導的軟骨細胞自噬來抑制細胞凋亡和炎癥信號傳導。

3 自噬相關信號通路通過調控BMSCs生物學行為作用于骨相關疾病發生發展

BMSCs是哺乳動物骨髓基質中發現的能夠分化產生軟骨、骨、脂肪、成肌細胞、神經的細胞群，其有多種類型，具有自我更新和多向分化的潛力。在不同條件下，BMSCs可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及神經細胞等多種類型的組織細胞，骨組織發育、骨代謝和骨修復均需要BMSCs的參與。BMSCs的自噬可影響其分化過程，進而影響骨量。目前已知與BMSCs自噬相關的信號通路主要有PI3K/Akt/mTOR信號通路、AMPK/mTOR信號通路、mTOR信號通路等。

3.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路 PI3K/Akt/mTOR信號通路可以通過調控自噬來調節BMSCs的成骨分化。ZHAO等［25］發現，益母草處理的SD大鼠BMSCs中ATG5、ATG7和LC3的mRNA和蛋白水平均上調，且益母草部分恢復了自噬抑制劑3-MA對大鼠BMSCs自噬的抑制作用。此外，在益母草處理后，大鼠BMSCs中PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，提示益母草通過PI3K/Akt/mTOR信號通路激活自噬，促進大鼠BMSCs成骨分化。LI等［26］研究發現，自噬參與了Ⅰ型神經纖維瘤病基因（NF1）調節的BMSCs成骨分化，且NF1可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控BMSCs的自噬。除PI3K作為上游分子調控Akt/mTOR外，DENG等［27］研究發現，缺氧可通過肌醇焦磷酸鹽（IP7）介導的Akt/mTOR信號通路促進BMSCs自噬和凋亡。

3.2 AMPK/mTOR信號通路 AMPK/mTOR信號通路在BMSCs的分化中起著重要作用，可調控BMSCs的自噬和凋亡。WANG等［28］用不同濃度的川芎嗪（TMP）處理BMSCs，并將其暴露于地塞米松（Dex）中48 h，發現TMP抑制Dex誘導的細胞毒性和保護BMSCs的凋亡，且TMP通過AMPK和mTOR途徑促進自噬，保護BMSCs。ZHANG等［29］研究發現，低氧應激增加了BMSCs的自噬和凋亡并呈時間依賴性，同時增加了AMPK/mTOR信號通路的活性；此外，自噬抑制劑3-MA可抑制低氧誘導的BMSCs凋亡，而自噬激活劑RAPA可加重低氧誘導的BMSCs凋亡；提示缺氧通過AMPK/mTOR信號通路調控BMSCs的凋亡和自噬。

3.3 mTOR信號通路 張樣聰等［30］研究發現，氯化鎘（CdCl2）能夠抑制人BMSCs成骨分化，其機制可能是通過上調11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-HSD1）、抑制mTOR信號通路并激活自噬實現的，提示CdCl2可能通過mTOR信號通路激活自噬，從而抑制成骨分化。RUOLAN 等［9］研究發現，C2SNPs能夠通過激活mTOR/ULK1信號通路誘導自噬，隨后觸發Wnt/β-catenin信號通路，促進BMSCs成骨細胞的分化。

4 自噬相關信號通路通過調控破骨細胞生物學行為作用于骨相關疾病發生發展

破骨細胞起源于骨髓單核髓性造血干細胞，是人體惟一的骨吸收細胞，在骨代謝平衡中具有重要作用。破骨細胞動員和分化成熟過程是一個復雜而又精細的多級調控過程，受到多種信號因子和通路的影響。自噬相關基因在破骨細胞的活性、分化等方面發揮關鍵性的調控作用，同時自噬還可通過相關信號通路來調控破骨細胞的生物學活性。目前已知與破骨細胞自噬相關通路主要由PI3K/Akt/mTOR信號通路、NF-κB信號通路、AMPK信號通路等。

4.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路 MA等［31］研究發現，在NF-κB受體活化因子配體（RANKL）誘導的破骨細胞分化過程中，胱硫醚b合酶（CBS）和胱硫醚c裂解酶（CSE）表達增加，硫化氫（H2S）促進RANKL誘導的破骨細胞生成，抑制成熟破骨細胞凋亡；其機制為H2S抑制Raw264.7細胞自噬并活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，自噬激活劑RAPA能夠減輕H2S對破骨細胞分化的誘導。這提示H2S可以通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬，促進破骨細胞的形成。FU等［32］通過Dex誘導小鼠骨質疏松發現，Dex處理的小鼠骨小梁顯微結構惡化，破骨細胞數量和擴散面積增加，自噬體數量增加，自噬相關蛋白水平上調。此外，在Dex處理下原代培養的破骨細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG1、ATG13和ATG7水平增加；而原代培養的破骨細胞中PI3K、p-Akt和pmTOR表達受到抑制，使用選擇性PTEN抑制劑SF1670可激活PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑，逆轉Dex處理下的破骨細胞自噬。這提示糖皮質激素通過PI3K/Akt/mTOR信號通路增強破骨細胞自噬，造成骨量的丟失。

4.2 NF-κB信號通路 NF-κB信號通路可通過激活自噬抑制破骨細胞形成及細胞活性。CHU等［33］發現，在體外實驗中，黃酮素（Nepetin）能有效抑制RANKL誘導的破骨細胞分化、形成和骨吸收；體內實驗中，Nepetin能保護小鼠顱骨免受鈦顆粒誘導的骨溶解；機制上，Nepetin抑制了RANKL誘導的NF-κB和MAPK信號通路的激活以及Beclin-1泛素化。這提示Nepetin通過抑制RANKL誘導的NF-κB和MAPK信號通路激活以及自噬來抑制破骨細胞的形成。LIU等［34］研究發現，異甘草素（ISL）能夠抑制RANKL誘導的破骨細胞生成，且抑制LC3Ⅱ和Beclin-1表達，而RAPA激活自噬逆轉了ISL誘導的抗破骨細胞作用。ISL抑制了RANKL誘導的NF-κB表達和核轉位，而NF-κB抑制劑Bay 11-7082顯著抑制了RANKL誘導的自噬激活，提示ISL可能通過抑制NF-κB依賴的自噬通路起到抗破骨細胞活性的作用。

綜上所述，自噬相關的PI3K/Akt/mTOR、mTOR、NF-κB、AMPK等信號通路在調控成骨細胞、軟骨細胞、BMSCs和破骨細胞的分化及活性方面有著非常重要的作用。而各種信號通路并非完全相互獨立，他們通過細胞因子、蛋白質等物質相互連接形成復雜的調控網絡，交錯相織。鑒于這些研究，可以應用有關藥物來激活或抑制上述信號通路從而治療或阻斷常見骨疾病的發生。然而，到目前為止，應用于臨床治療的相關藥物的開發、使用有限，因此，需要對這些機制進行深入的研究，從而為臨床治療相關骨疾病提供理論依據。