中藥調控Notch信號通路治療骨質疏松癥的研究

楊浩東 謝興文 李寧 李鼎鵬 丁聚賢 姚乾寧劉凱

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000 2. 甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州730000 3. 甘肅省第二人民醫院/西北民族大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730030

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨代謝疾病，主要由于骨代謝過程中各種致病因素造成成骨細胞(osteoblast,OB)與破骨細胞(osteoclast,OC)介導的骨形成和骨吸收失衡，導致骨吸收大于骨形成。主要表現為單位體積內的骨量減少、骨密度(bone mineral density,BMD)下降以及骨微結構的改變，以致骨的脆性增加，增加患者的骨折風險[1-2]。據研究調查[3]，在我國50歲以上的人群中，男性的患病率約為6.46%，而女性由于絕經后體內雌激素分泌減少，患病率達到了29.13%，尤其在60歲以上人群中，OP患病率明顯增高。由OP并發的骨質疏松性骨折已成為造成中老年人群殘疾和死亡的主要原因之一[4]，給患者及家庭帶來了沉重的經濟負擔和嚴重的社會負擔[5]。

目前，在臨床上治療OP主要以西醫治療為主，患者通過服用甲狀旁腺素、維生素D等促進骨形成的藥物以及降鈣素、雙膦酸鹽等抑制骨吸收的藥物來改善骨質情況，但是這些藥物都有明顯的不良反應和副作用[6]，并且臨床治療效果也難以令人滿意。近年來，中醫藥以其多生物活性成分、多靶點、多通路協同、高效價廉和副作用少的治療優勢在OP的防治中發揮了重要的作用，并且取得了良好的臨床療效。神經源性位點缺口同源蛋白(Notch)信號通路作為細胞內一條重要的信號傳導通路，能夠參與多種疾病的發生和發展。相關研究證實[7]，Notch信號通路作為重要的骨重建通路在調控與維持骨代謝穩定方面發揮著至關重要的作用，可以通過影響OB和OC的分化和平衡，從而促進骨的形成，抑制骨的吸收，是當今研究和治療OP的新靶點。因此，可以通過調控Notch信號通路相關蛋白的表達，影響相關骨細胞的代謝，從而糾正機體的骨失衡狀態，恢復成骨量與破骨量之間的動態平衡。本文將對中藥單體及復方調控Notch信號通路防治OP的相關研究進行綜述，闡明運用中藥單體及復方干預影響Notch信號通路相關靶蛋白的表達治療OP的作用機制，以期為運用中醫藥更好的防治OP提供有益參考。

1 Notch信號通路

1.1 Notch信號通路的組成

摩爾根在做果蠅突變實驗時發現了Notch信號通路，因其代表的功能缺失使得果蠅翅膀形成缺刻而命名[8]。Notch信號通路在高、低等動物體內均有表達，具有高度保守的特性，主要由受體、配體、DNA結合蛋白、DNA結合蛋白胞內效應分子、效應物以及調節分子組成。在哺乳動物體內，Notch通路主要由4種受體蛋白(Notch-1、2、3、4)和5種配體蛋白(Delta-1、3、4，Jagged-1、2)以及Notch調節因子及下游發狀分裂相關增強子(hairy and enhancer of split,Hes)、Hey蛋白組成[9]，在細胞的增殖和分化以及凋亡等過程中有著十分重要的調控作用[10]，在許多生物體內的組織和器官中都發揮著重要的作用。

1.2 Notch信號通路的激活過程

Notch通路以細胞間接觸的方式進行信號傳遞，因此又被稱之為復合信號結合蛋白-J(recombination signal binding protein-J,RBP-J)依賴通路，其通過細胞表面的配體蛋白與相鄰細胞表面的受體相結合的方式進行信號傳遞過程。Notch通路的活化需要經過三個階段[11]：①受體蛋白是由多肽段構成的異二聚體，在內質網合成之后，轉移至高爾基體，在弗林蛋白轉化酶的作用下，行第1次酶切，被切割為N端胞外配體結合區和C端跨膜亞單位；②在配體與受體結合后，在去整合素金屬蛋白酶作用下，行第2次酶切，使受體釋放細胞外亞單位；③切割產生的Notch片段被γ-分泌酶第3次酶切，釋放Notch細胞內區(notch intracellular domain,NICD)入核，在細胞核內與轉錄因子RBP-J、智者基因樣特異性結合形成核轉錄激活蛋白家族復合體，對下游Hes、Hey蛋白進行調控，轉錄下游基因發揮生物學功能[12]。

2 Notch信號通路與OP

2.1 Notch信號通路對OB的影響

OB是骨形成的主要功能細胞，能夠影響骨的形成和重建過程，來源于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。OB由BMSCs分化而來，此過程經歷了由不同轉錄因子及信號蛋白調控的多個階段。研究發現[13]，Notch信號通路能夠影響OB的增殖、分化和骨化等過程，能夠激活BMSCs前體向OB分化。Notch通路在調節過程中具有雙向調節的作用，在早期成骨分化中發揮促進成骨的作用，而后期則抑制OB的增殖和分化。激活BMSCs中的Notch信號通路，不僅可以促進BMSCs的增殖，而且能夠維持其干細胞特性，抑制BMSCs的分化，而在BMSCs中抑制Notch信號通路的激活，則可以促進干細胞的分化，使其進入成骨或成軟骨的狀態[14]。研究發現[15]，Notch信號通路的配體蛋白Jagged-1是BMD的決定因子，Jagged-1蛋白的大量表達能夠促進骨折的早期愈合，并且抑制BMSCs高密度長期培養所導致的細胞老化，增強其成骨分化。Notch信號通路能夠正向調節骨形成蛋白信號抑制劑頭蛋白(Noggin)的釋放，從而促進骨小梁形成，增加成骨前體細胞的數量[16]。

2.2 Notch信號通路對OC的影響

OC是骨吸收的主要功能細胞，在骨的發育、成長、修復和重建過程中發揮著重要作用，來源于骨髓造血干細胞。有報道[17]指出Notch信號通路與OC的增殖和凋亡過程密切聯系，通過下調Notch信號通路的活性可以達到抑制OC凋亡，增加OC增殖能力的作用，Notch通路中的Nocth-1蛋白高表達可以促進δ樣配體3、Jagged-1的表達，使OC形成數量明顯減少[18]，而Nocth-2的表達量與OC的增殖能力呈正相關。相關研究[19]發現，微小RNA對OC的活性有著重要的影響，miR-187可以通過增強Nocth-1通路的活性，抑制Nocth-2通路達到抑制OC的增殖與分化，并且誘導OC凋亡，減少OC的存活。

3 中藥調控Notch信號通路與OP

3.1 中藥單體

隨著對中藥單體研究的深入，大量實驗結果表明，中藥單體在防治OP方面有著顯著的治療效果。骨碎補作為骨科常用藥，現代藥理學研究證明[20]，其主要有效成分總黃酮(davallia mariesil flavones,DMF)能夠維持OP患者的骨微結構的完整程度，并提升BMD。研究證實[21]，DMF能夠顯著降低骨髓基質細胞中Notch-1 mRNA、Hes-1 mRNA以及Notch-1、Hes-1等蛋白的表達水平，其促進骨形成，抑制骨吸收，增加BMD的作用機制與Notch信號通路相關。前期研究證實[10]，齊墩果酸(oleanolic acid,OA)能抑制Notch信號通路的激活，且呈現劑量依賴性，能夠促進BMSCs早期的OB分化，從而促進骨形成。程韶等[22]通過微型滲透泵對去勢大鼠骨折部位進行局部緩釋OA干預，實驗發現，OA能夠促進骨折的愈合，且干預14 d的作用顯著大于28 d，證實了OA能夠促進早期骨形成，通過降低骨痂組織中Hes1 mRNA的表達，抑制Notch通路靶基因Hes1的表達從而促進BMSCs的成骨分化。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是中藥虎杖的活性單體，研究發現[23]RES能夠通過調控Notch通路，上調Notch-1的表達，上調cyclin-D1的m RNA轉錄水平，而下調負調控細胞的分裂及增殖的p53的m RNA轉錄水平，促進大鼠骨組織中的OB增殖。淫羊藿作為傳統中藥，最早見于《神農百草經》，具有補腎壯陽，祛風除濕的功效[24]。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要有效成分之一，研究[25]發現其具有維持骨代謝平衡、誘導骨形成、增加BMD的作用。淫羊藿苷能夠促進Notch通路中Notch-1、Jagged-1 、C-啟動子結合因子-1等蛋白的表達，上調Hesl mRNA和Runt相關轉錄因子2 mRNA表達，促進BMSCs向OB分化，從而發揮防治OP的作用[26]。

另有研究指出[27-29]，刺五加苷、補骨脂素和連翹酯苷A等中藥有效成分均能通過介導Notch信號通路干預BMSCs的成骨分化，并且影響相關骨細胞的凋亡防治OP。

3.2 中藥復方

中醫認為，OP發生的根本病因是由于患者肝腎虧虛所引起，如《黃帝內經·素問》中所云“腎氣熱，……骨枯而髓減，發為骨痿。”在治療方面，《素問》曰 “腎者，……封藏之本，……其充在骨，……通于冬氣。”明確了腎具有壯骨生髓的作用。因此，從古到今各代醫家治療OP的遣方用藥都以補肝腎為要，并且在臨床的應用中取得了良好的治療效果。

劉蔚楠等[30]探討了益腎健骨膏對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝的影響，研究發現模型組大鼠腰椎中的Notch 1、2及其配體Jagged 1、2的mRNA及蛋白表達均顯著降低，而在經過益腎健骨膏的治療后，高劑量膏方組中大鼠的BMD、骨強度及骨形成指標都顯著提升，而骨吸收的指標水平顯著降低，并且除模型組之外，其余各組中上述基因的mRNA及蛋白表達均顯著提高，證明益腎健骨膏可能通過影響Notch通路蛋白的表達促進骨形成，抑制骨吸收，從而減少去勢大鼠骨量的丟失。吳結枝等[31]的研究發現，壯骨止痛膠囊能夠通過調控BMSCs的Notch信號通路，提高Hes、Notch-1、Jagged-1等蛋白的表達水平，調節BMSCs向OB分化，改善絕經后骨質疏松模型大鼠骨基質的分子結構，提高BMD。許日明等[32]研究了溫腎固疏方對絕經后骨質疏松癥腎陽虛型患者的影響，發現溫腎固疏方組患者在治療后BMSCs中的Notch-1、Jagged-1、Hes-1的mRNA等蛋白的表達水平均高于其他組，提示溫腎固疏方可能通過調節Notch通路提高類固醇受體活化輔激活因子3、過氧化物酶體增殖活化受體-1a、B淋巴細胞瘤-2水平，恢復BMSCs功能，促進OB生長，提高患者BMD。實驗證明[33]，固本增骨方能夠促進BMSCs進行增殖，并促進其進行成骨分化、而抑制其成脂分化，通過上調Notch-1 mRNA的表達水平以及下調C啟動子結合因子1 mRNA水平，從而促使BMSCs成骨分化過程中Ⅰ型膠原蛋白、Runt相關轉錄因子2、骨鈣蛋白等成骨基因蛋白的表達，促進OB的增殖。

另有研究證明[34-39]，補腎方藥如左歸丸、右歸丸、補腎復方和益骨膠囊等均可以通過調控Notch通路活性，影響與成骨和破骨相關細胞的增殖和凋亡，有效發揮骨質疏松癥的防治作用。

4 小結

綜上所述，現有的研究結果證明中藥單體及中藥復方治療OP的效果顯著，且具有多方向調節、多靶點干預的治療特點，可以通過調控Notch信號通路相關蛋白的活性，調節靶基因蛋白的表達，影響BMSCs、OB、OC等細胞的增殖分化和凋亡，維持骨形成和骨吸收的動態平衡，達到防治OP的效果。

但目前基于此通路防治OP的中醫藥療法基本以中藥單體及中藥復方為主，未涉及針灸、穴位貼敷、臟腑推拿等具有中醫特色療法在此方面的研究，且大部分現有的研究也僅停留在動物實驗研究的基礎階段，這也是今后應努力研究的方向和目標。下一步應致力于探究臨床研究的治療效果，同時以Notch信號通路為支點，挖掘出更多的中藥有效成分和中藥復方，擴大中醫藥特色療法防治OP的應用范圍，探究與其他通路的協同治療作用。