基于響應面法的醬油發酵條件對蛋白質利用率影響分析

趙娜，段志霞，王慧

(1.濟源職業技術學院 基礎部，河南 濟源 459000；2.南陽理工學院，河南 南陽 473004)

醬油營養豐富且具有獨特的風味，含有多種氨基酸和有機化合物[1]。醬油是以大豆或植物蛋白為原材料，在米曲霉制曲發酵作用下生產而成，根據醬油生產工藝方法可將醬油分為高鹽稀態發酵醬油和低鹽固態發酵醬油[2-3]。高鹽稀態發酵醬油的生產周期長，生產成本較高；低鹽固態發酵醬油的生產周期短，且原材料價格低廉[4-5]。響應面分析法通過建立各影響因子和結果之間的函數關系，分析影響因子對結果的影響，尋找結果最優的影響因子[6]。本文以非轉基因大豆為原材料，采用低鹽固態發酵的方法，結合響應面進行分析，對醬油發酵條件進行優化，提高醬油發酵過程中的蛋白質利用率。

1 試驗測定與分析方法

采用凱氏定氮法對原材料中的蛋白質含量進行測定，同時對不同發酵條件下所得到的醬油中蛋白質含量進行測定，計算出醬油發酵過程中的蛋白質利用率[7]：

式中：η表示蛋白質利用率；n表示成品醬油中的蛋白質總量,g；m表示醬油原材料中的蛋白質總量,g。

醬油發酵過程中影響因素主要包括米曲霉與黑曲霉體積比、發酵溫度、發酵時間以及鹽水濃度[8-10]。本文分別在不同工藝條件下對醬油發酵過程進行單因素試驗，醬油發酵條件單因素試驗見表1。

表1 醬油發酵條件單因素試驗Table 1 Single factor test for soy sauce fermentation conditions

在單因素試驗完成后，對蛋白質利用率進行測定和計算，確定米曲霉與黑曲霉體積比、發酵溫度、發酵時間以及鹽水濃度對醬油發酵過程中蛋白質利用率的影響，并獲取發酵條件因素3個水平的最佳參數，設計響應面分析試驗水平編碼表[11-12]。響應面分析因素水平見表2。

表2 醬油發酵響應面分析因素水平表Table 2 Factors and levels of soy sauce fermentation response surface analysis

2 單因素試驗結果分析

2.1 米曲霉與黑曲霉體積比對蛋白質利用率的影響

米曲霉與黑曲霉體積比對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果見表3。

表3 米曲霉與黑曲霉體積比對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果Table 3 Effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger on single factor test of protein utilization rate

由表3可知，當米曲霉與黑曲霉體積比從1∶3增加到2∶1時，原材料蛋白質利用率隨著米曲霉與黑曲霉體積比的增加而升高，當米曲霉與黑曲霉體積比為2∶1時，原材料蛋白質利用率達到最高值85%，當米曲霉與黑曲霉體積比大于2∶1時，隨著米曲霉與黑曲霉體積比的增加，原材料蛋白質利用率逐漸降低。醬油發酵過程中，米曲霉可分泌出中性和堿性蛋白酶，黑曲霉可分泌出酸性蛋白酶，在不同的米曲霉與黑曲霉體積比條件下，二者蛋白酶配比不同，導致醬油發酵過程中原材料蛋白質利用率不同。

2.2 發酵溫度對蛋白質利用率的影響

發酵溫度對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果見表4。

表4 發酵溫度對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果Table 4 Effect of fermentation temperature on single factor test of protein utilization rate

由表4可知，當發酵溫度從15 ℃升到45 ℃時，原材料蛋白質利用率隨著溫度的升高而逐漸升高，當發酵溫度為45 ℃時，原材料蛋白質利用率達到最高值88%，當發酵溫度大于45 ℃時，隨著溫度的升高，原材料蛋白質利用率逐漸降低。醬油發酵過程中，酶活力主要受溫度的影響，過高或過低的溫度均會使酶活力降低，對醬油發酵過程中原材料蛋白質利用率產生不同程度的影響。

2.3 發酵時間對蛋白質利用率的影響

發酵時間對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果見表5。

表5 發酵時間對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果Table 5 Effect of fermentation time on single factor test of protein utilization rate

由表5可知，當發酵時間從60 d增加到100 d時，原材料蛋白質利用率隨著發酵時間的延長而逐漸升高，當發酵時間為100 d時，原材料蛋白質利用率達到最高值87%，當發酵時間大于100 d時，隨著發酵時間的延長，原材料蛋白質利用率逐漸降低。

2.4 鹽水濃度對蛋白質利用率的影響

鹽水濃度對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果見表6。

表6 鹽水濃度對蛋白質利用率單因素試驗的影響結果Table 6 Effect of brine concentration on single factor test of protein utilization rate %

由表6可知，當鹽水濃度從8%增加到12%時，原材料蛋白質利用率隨著鹽水濃度的增加而逐漸升高，當鹽水濃度為12%時，原材料蛋白質利用率達到最高值87%，當鹽水濃度大于12%時，隨著鹽水濃度的升高，原材料蛋白質利用率逐漸降低。食鹽能夠有效抑制發酵過程中微生物的生長，同時也會對酶活力產生影響，當鹽水濃度過高時，蛋白酶活力降低，原材料蛋白質利用率也隨之降低。

3 醬油發酵條件響應面分析

在醬油發酵條件單因素試驗完成后，確定米曲霉與黑曲霉體積比、發酵溫度、發酵時間以及鹽水濃度四因素三水平試驗，對醬油發酵過程進行響應面試驗分析，結果見表7。

表7 醬油發酵過程響應面分析試驗結果Table 7 Response surface analysis test results of soy sauce fermentation process

續 表

由表7可知，醬油發酵過程中蛋白質利用率最高時所對應的發酵條件為米曲霉與黑曲霉體積比2∶1、發酵溫度45 ℃、發酵時間100 d以及鹽水濃度12%，此時蛋白質利用率可達到88.76%。利用Box-Behnken對表7中的試驗數據進行二次響應面回歸分析，確定醬油發酵過程中4個因素的回歸方程為Y=88.35-6.35A2-0.34B2-4.39C2-9.18D2+1.03A-1.16B+0.52C+0.019D-0.92AB-1.39AC+0.052AD-0.91BC+0.21BD-0.02CD。

對二次響應面回歸方程進行分析，確定模型方差和回歸系數的顯著性，P<0.01表示該分析項極顯著[14]。回歸方程方差分析結果見表8。

表8 回歸方程方差分析結果Table 8 Results of variance analysis of regression equation

由表8可知，在醬油發酵過程中，蛋白質利用率的一次項和二次項為極顯著，表明醬油發酵過程中的4個因素與響應值之間的關系不是一次線性關系，醬油發酵過程中的4個因素相互作用，構成醬油發酵過程中蛋白質利用率響應曲面結果。蛋白質利用率的回歸項極顯著，表明二次響應面回歸方程具有較好的擬合程度，因此醬油發酵響應面試驗過程具有較高的可信性和準確性。蛋白質利用率的失擬項不顯著，表明醬油發酵響應面試驗過程誤差較小。

利用Design-Expert繪制醬油發酵過程中米曲霉與黑曲霉體積比(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)以及鹽水濃度(D)4個因素對蛋白質利用率的響應面圖。米曲霉與黑曲霉體積比和發酵溫度對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖1，米曲霉與黑曲霉體積比和發酵時間對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖2，米曲霉與黑曲霉體積比和鹽水濃度對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖3，發酵溫度和發酵時間對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖4，發酵溫度和鹽水濃度對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖5，發酵時間和鹽水濃度對醬油發酵過程中蛋白質利用率影響的響應面見圖6。

圖1 米曲霉與黑曲霉體積比和發酵溫度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.1 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and fermentation temperature on protein utilization rate

圖2 米曲霉與黑曲霉體積比和發酵時間對蛋白質利用率影響的響應面Fig.2 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and fermentation time on protein utilization rate

圖3 米曲霉與黑曲霉體積比和鹽水濃度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.3 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and brine concentration on protein utilization rate

圖4 發酵溫度和發酵時間對蛋白質利用率影響的響應面Fig.4 Response surface diagram of effect of fermentation time and fermentation temperature on protein utilization rate

圖5 發酵溫度和鹽水濃度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.5 Response surface diagram of effect of fermentation temperature and brine concentration on protein utilization rate

由圖1～圖6可知，醬油發酵過程中米曲霉與黑曲霉體積比、發酵溫度、發酵時間以及鹽水濃度4個因素對蛋白質利用率響應值的敏感程度不同，其中米曲霉與黑曲霉體積比對蛋白質利用率響應值的影響最顯著，發酵時間對蛋白質利用率響應值的影響強于發酵溫度，鹽水濃度對蛋白質利用率響應值的影響最弱。

根據分析結果確定，在醬油發酵過程中，最佳發酵工藝條件為米曲霉與黑曲霉體積比2∶1、發酵溫度45 ℃、發酵時間100 d以及鹽水濃度12%，此時蛋白質利用率最高。并以此條件構建醬油發酵條件進行驗證試驗，同一發酵條件共進行3組試驗，并計算醬油發酵過程中蛋白質利用率。醬油發酵最佳條件試驗驗證結果見表9。

表9 醬油發酵最佳條件試驗驗證結果Table 9 Experimental verification results of the optimum conditions for soy sauce fermentation

由表9可知，對以響應面確定的最佳發酵條件進行試驗驗證時，醬油發酵過程中蛋白質利用率可達到88.99%，3組試驗所得蛋白質利用率相對誤差為0.35%，表明該二次響應面回歸方程與實際發酵過程之間具有較好的擬合性，能夠用于醬油發酵過程條件的優化和指導。

4 結論

采用單因素試驗的方式獲取醬油發酵過程中因素水平變化范圍，并設計響應面分析過程中的3個水平試驗條件因素，利用Design-Expert對響應面試驗結果進行分析，確定醬油發酵過程的最佳工藝條件。本試驗有效提高了醬油發酵過程中的蛋白質利用率，改善了醬油風味，為醬油的工業化生產提供了理論基礎。