杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁品質的影響

張麗華，唐培鑫，查蒙蒙，馮路瑤，縱偉*

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，鄭州 450001；3.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，鄭州 450001)

杜仲是中國特有的名貴滋補中藥材[1]。最新研究表明，杜仲葉富含黃酮、多糖、多酚等活性成分，具有與杜仲皮相似的降血壓、降血糖、抗炎和抗骨質疏松等功能[2-3]。杜仲葉在2005年被載入《中華人民共和國藥典》，2018年納入藥食兩用物質管理。在中國的湖南省和河南省等地，有將杜仲嫩葉入菜、煮粥、泡茶及制作主食的飲食習俗[4-5]。近年來，利用杜仲葉開發的產品有杜仲茶、杜仲葉飲料、杜仲葉浸膏粉等[6-8]，但將其作為配料應用在食品加工中的研究較少。

超微粉碎技術是生產保健品和功能性食品的新型加工技術，能最大限度地保留天然活性物質的功能。已有研究表明，超微粉碎能夠增加天然可食植物中總酚和總黃酮的溶出[9]。陳書明等[10]發現提高面包中杜仲葉超微粉(superfine powder ofEucommiaulmoidesOliv.leaves，SPEL)的添加量，有利于增強其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力；Zhang等[11]研究發現杜仲葉超微粉碎后，更有利于杜仲葉功能性食品的開發。

近年來，益生菌發酵果蔬汁飲料因具有改善人體腸道菌群，改善便秘和乳糖不耐癥，抑制一些腐敗菌在腸道內定植等功能受到許多消費者的青睞。益生菌在蘋果汁發酵中研究表明，植物乳桿菌發酵不僅能在一定程度上抑制蘋果汁氧化酶的活性，而且能夠提高發酵蘋果汁的抗氧化活性和賦予果汁香氣[12]。然而，益生菌發酵過程中蘋果汁的總酚、綠原酸、原花青素B2含量降低[13-14]。但是還有研究表明，植物乳桿菌發酵在降低桑葉的苦味[15]、提高木瓜葉的總酚和非洲茄香草酸、醋酸、鐵藻酸、黃酮類(卡欽、奎辛和葉黃素)和抗壞血酸的功能性成分含量等方面效果顯著[16-17]。目前，已有研究發現桑葉和植物乳桿菌混合發酵能夠提高奶酪的營養價值[18]；橄欖葉和植物乳桿菌混合發酵能夠提高餐用橄欖的總酚含量[19]。因此，本研究將SPEL添加到蘋果汁中，探究SPEL不同添加量(1%、2%、3%)對發酵蘋果汁中總酚、黃酮、有機酸等功能性成分和香氣的影響，可為杜仲葉功能性產品開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘋果：購于當地丹尼斯超市；杜仲葉：2021年6月采自國家林業局泡桐研究開發中心杜仲種植基地；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumCICC 20022)：中國工業微生物菌種保藏中心。

福林酚：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、硝酸鋁、蘋果酸、酒石酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；MRS肉湯、MRS培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶、纖維素酶：江蘇銳陽生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸：洛陽昊華化學試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、檸檬酸：天津市大茂化學試劑廠；乳酸：鄭州派尼化學試劑廠；甲酸：阿拉丁試劑有限公司；乙酸：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SC-80C全自動色差儀 北京康光光學儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠；PAL-1數顯折光糖度儀 日本ATAGO公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BPH-9272精密恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 上海浦東榮豐科學儀器有限公司；PEN3 電子鼻系統 德國AIRSENSE公司；Agilent G4212.60008型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；PM100行星式球磨儀 弗爾德(上海)儀器設備有限公司；TECAN酶標儀 勒菲生物科技(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將凍干菌粉在MRS肉湯培養基中活化后，吸取0.75 mL于1.5 mL的離心管中，用甘油1∶1冷凍保藏，然后配制100 mL MRS肉湯培養基，經煮沸溶解、高壓蒸汽滅菌(0.1 MPa，121 ℃，20 min)、冷卻至室溫后，加入1管保藏在甘油中的植物乳桿菌菌液，搖勻，在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，按照1%的接種量轉接2代后得到活化好的植物乳桿菌培養液。培養液離心取沉淀即得到植物乳桿菌菌泥，用無菌水重懸2次后，配制成濃度為0.1 g/mL的菌懸液，備用。

1.3.2 植物乳桿菌發酵蘋果汁的制備

杜仲葉超微粉(superfine powder ofEucommiaulmoidesOliv.leaves，SPEL)的制備：將新鮮杜仲葉清洗，置于50 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中脫水烘干。將烘干好的杜仲葉進行超微粉碎，用粒度儀測得平均粒徑為200 μm，裝袋密封放在干燥器中備用。

蘋果經清洗、去皮、切片熱燙1 min后進行打漿，向蘋果漿中分別添加1%、2%、3%的SPEL。用纖維素酶∶果膠酶為2∶1的復合酶于40 ℃酶解4 h，經過濾、離心后得到的澄清液于0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min，待其冷卻至室溫后添加4%的植物乳桿菌菌懸液，在37 ℃的培養箱中進行發酵，取發酵0，12，24，36，48 h的樣品進行測定。

1.3.3 植物乳桿菌活菌數的測定

植物乳桿菌活菌數的測定方法參考GB 4789.35—2016[20]。

1.3.4 pH值的測定

采用PHS-3C pH計直接測定。

1.3.5 可溶性固形物的測定

采用PAL-1數顯折光糖度儀，單位記為°Brix。

1.3.6 色差的測定

取一定體積的發酵液離心，得上清液，以蒸餾水為對照，用色差儀測定色差值。其中L*代表亮度，a*代表紅綠色度，b*代表黃藍色度，ΔE*越大表明色差越大。

1.3.7 功能性成分的測定

1.3.7.1 總糖、還原糖的測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法進行測定[21]。

總糖含量測定：取1 mL發酵液于50 mL的燒杯中，加入5 mL HCl，混合均勻后于68 ℃水浴15 min，冷卻后分別用2 mol/L 和0.1 mol/L NaOH溶液將其中和至中性，定容至100 mL的容量瓶中制成待測液。取0.4 mL待測液于具塞管中，加蒸餾水補至0.4 mL后分別加入0.8 mL的DNS試劑，混合均勻進行5 min的沸水浴，冷卻至室溫后加水定容至10 mL，在540 nm處測定吸光度值。

還原糖含量測定：取1 mL發酵液于10 mL離心管中，50 ℃水浴20 min，離心后取上清液加水定容至100 mL，制成待測液。取0.4 mL待測液于具塞管中，按照總糖含量的測定方法測定吸光度值。

總糖、還原糖含量均按式(1)計算：

(1)

式中：X為樣品中總糖或還原糖的含量(以葡萄糖計)，mg/mL；C為根據標準曲線計算得出的葡萄糖濃度，mg/mL；V0為樣品體積，mL；V1為待測液定容體積，mL。

1.3.7.2 總酚的測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteus法測定[22]：取1 mL發酵液，加入25 mL pH為3.0的70%酸性乙醇，避光反應30 min后在80 ℃恒溫水浴60 min。離心取上清液，濾渣用乙醇洗滌2次，合并濾液，定容于50 mL容量瓶中，得到待測液。取1 mL待測液于25 mL比色管中，加水稀釋至6 mL后，再分別加入0.5 mL福林酚試劑、1 mL 15%的Na2CO3溶液，避光反應30 min后加水定容至25 mL，以零管為對照，在760 nm處測定吸光度值。

總酚含量按式(2)計算：

(2)

式中:X為樣品中總酚的含量(以沒食子酸計)，mg/dL；C為根據標準曲線計算得出的沒食子酸濃度，μg/mL；V0為樣品體積，mL；V1為比色定容體積，mL；V2為待測液定容體積，mL。

1.3.7.3 總黃酮的測定

采用硝酸鋁絡合法測定[23]。取1 mL發酵液于25 mL具塞比色管中，用30%乙醇溶液定容至6 mL后，分別加入1 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min后，再加入1 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min后，最后加入10 mL 10%的NaOH溶液，用30% 乙醇定容至25 mL，搖勻靜置15 min。以零管為對照，于510 nm處測定吸光度值。總黃酮含量按式(3)計算：

(3)

式中：X為樣品中總黃酮的含量(以蘆丁計)，mg/dL；C為根據標準曲線計算得出的蘆丁濃度，μg/mL；V0為樣品體積，mL；V1為比色定容體積，mL。

1.3.7.4 有機酸的測定

采用高效液相色譜法對有機酸含量進行測定。

色譜條件：Agilent填充柱C18(4.60 mm×250 mm，5 μm)，流動相:KH2PO4(0.02 mol/L,pH 2.60)∶甲醇為92∶8(體積比)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，配備PDA檢測器，檢測波長為210 nm。

樣品測定：發酵液經5000×g離心10 min，0.22 μm濾膜過濾得上清液，用外標法進行定量。通過各標準品的標準曲線對蘋果汁中有機酸含量進行定量，以mg/L表示。

1.3.8 香氣的測定

精確量取發酵液8 mL于樣品瓶中，于50 ℃水浴10 min后，將電子鼻探頭插入樣品瓶中，通過頂空吸氣法用電子鼻進行測定。電子鼻參數設置：清洗時間 100 s，樣品測定時間 60 s，進樣流量和載氣流量均為 400 mL/min。電子鼻傳感器名稱及敏感物質參數見表1。

表1 電子鼻傳感器名稱及敏感物質Table 1 Names and sensitive substances of electronic nose sensors

續 表

1.4 數據統計與分析

所有數據均為3次獨立重復試驗的平均值，數據表示為“平均值±標準差”。采用SPSS統計軟件進行差異顯著性分析，通過Origin函數繪圖軟件制圖。電子鼻數據采用WinMuster 軟件進行主成分分析(PCA)和載荷分析(loading analysis)。

2 結果與分析

2.1 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁活菌數的影響

不同添加量的SPEL對蘋果汁發酵過程中活菌數的影響見圖1。

圖1 杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁活菌數的影響Fig.1 Effect of the addition amount of SPEL on the viable count of fermented apple juice

在發酵過程中，4組蘋果汁的活菌數均呈先上升后下降的趨勢。隨著SPEL添加量的增加，發酵蘋果汁中植物乳桿菌的活菌數增多，發酵36 h時，各組蘋果汁中活菌數均達到最大。發酵36 h后，活菌數呈下降趨勢。產生這種現象的原因是植物乳桿菌代謝過程中產生乳酸，抑制了植物乳桿菌的生長；另一方面可能是SPEL對植物乳桿菌的生長有類似嗜酸乳桿菌的促進作用，因此添加SPEL的活菌數始終大于對照組的活菌數[24]。

2.2 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁pH和可溶性固形物的影響

蘋果汁酸度高，使得植物乳桿菌在較低的pH環境下發酵時間長、活菌數增幅低[25]。

由圖2中A可知，發酵0 h時，與對照組蘋果汁的pH(2.75)相比，隨著SPEL添加量的增加，蘋果汁的pH分別升高至2.93，3.07，3.12。結合圖1可知，添加SPEL可以通過提高蘋果汁的pH，避免低酸環境對植物乳桿菌生長能力的抑制，更適合植物乳桿菌的生長。隨著發酵時間的增加，對照組的pH下降了26.91%，3組添加SPEL的蘋果汁pH分別下降了26.96%、28.01%、29.17%，主要是植物乳桿菌在代謝過程中產生乳酸，也表明高添加量的SPEL能夠促進植物乳桿菌在蘋果汁中的生長。

圖2 杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁pH(A)和可溶性固形物(B)的影響Fig.2 Effect of the addition amount of SPEL on pH (A) and soluble solid (B) of fermented apple juice

由圖2中B可知，在發酵0 h時，對照組的可溶性固形物含量為9.07°Brix，隨著SPEL添加量的增加，可溶性固形物含量分別增加了3.64%、9.15%、12.79%，可能是由于杜仲葉中富含膠質，在發酵前進行的酶解處理中使用的果膠酶可以將杜仲葉中的膠質酶解成小分子物質，使細胞壁疏松，從而降低擴散阻力，使細胞內的可溶性固形物充分溶解出來[26]。在發酵前后，與對照組相比，不同SPEL添加量的蘋果汁可溶性固形物含量具有顯著性差異，其中添加3% SPEL的蘋果汁中可溶性固形物含量一直顯著高于其他3組。發酵48 h后，4組樣品的可溶性固形物含量分別降低至8.87，9.13，9.43，10.07°Brix，可能是植物乳桿菌利用了蘋果汁基質中大量的可溶性糖。

2.3 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁色差的影響

色澤是評價果汁感官品質的重要因素，除了能測得產品本身的質量，還可以影響人們對產品的主觀感受或喜歡程度。杜仲葉的顏色為深綠色，其添加量的變化會影響果汁的色澤。

由表2可知，與對照組相比，隨著SPEL添加量的增加，蘋果汁的L*值顯著降低(P<0.05)，果汁色澤變暗；a*值和b*值顯著增加(P<0.05)，蘋果汁的紅黃色得到顯著改善。隨著發酵時間的增加，樣品的色澤值L*、a*和b*變化不明顯，與De Oliveira等[27]利用復合菌株分別發酵西印度櫻桃和番石榴后果汁亮度均顯著提高的結果不一致，這可能是發酵基質不同導致的，也可能是SPEL自身顏色影響了發酵過程中果汁的色澤變化。

表2 杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁色澤的影響Table 2 Effect of the addition amount of SPEL on the color of fermented apple juice

2.4 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁總糖和還原糖的影響

不同添加量的SPEL對蘋果汁總糖和還原糖的影響見圖3中A。在發酵前，4組樣品的總糖質量濃度分別為27.46，28.67，30.10，30.79 g/L，在發酵24～36 h內，4組果汁中總糖含量分別降低7.87%、11.84%、13.33%、13.46%。隨著SPEL添加量的增加，總糖消耗越多，作為碳源被植物乳桿菌的生長所利用。由圖3中B可知，SPEL能提高果汁中還原糖的含量，且還原糖含量隨著SPEL添加量的增加而增加。其中3% SPEL組的還原糖含量顯著高于其他3組(P<0.05)，對照組和1% SPEL組的還原糖含量在發酵前24 h內呈上升趨勢，可能是由于發酵過程中，植物乳桿菌將果汁中的蔗糖和多糖轉化為還原糖[28]。

圖3 杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁總糖(A)、還原糖(B)的影響Fig.3 Effect of the addition amount of SPEL on the total sugar (A) and reducing sugar (B) of fermented apple juice

2.5 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁總酚和總黃酮的影響

由圖4可知，隨著SPEL添加量的增加，蘋果汁中總酚和總黃酮含量顯著增加。由圖4中A可知，與對照組相比，1%、2%和3% SPEL的樣品中，總酚含量分別增加了56.76%、108.11%、150.00%。由圖4中B可知，1%、2%、3% SPEL的樣品中，黃酮含量分別增加了100.00%、271.43%、300.00%。前人研究結果表明，杜仲葉中多酚和總黃酮含量較高[29]，羅磊等發現利用果膠酶酶解能增加杜仲葉中黃酮的釋放量。植物乳桿菌在發酵過程中為了保持生長會降解酚類物質，導致在發酵過程中總酚和總黃酮含量降低[30]。蘋果汁發酵36 h后，總酚和總黃酮含量增加，可能是由于蘋果汁中存在一定含量的植物乳桿菌，將大分子酚類化合物解聚，轉化簡單的酚類物質[31]。

圖4 杜仲葉超微粉添加量對發酵蘋果汁總酚(A)、總黃酮(B)的影響Fig.4 Effect of the addition amount of SPEL on the total phenols (A) and total flavonoids (B) of fermented apple juice

2.6 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁有機酸含量的影響

果汁中的有機酸含量對其營養品質和感官特性有很大的影響[32]。試驗測定了植物乳桿菌發酵蘋果汁中的7種有機酸含量，7種有機酸相關系數見表3，有機酸測定結果見表4。

表3 不同有機酸的標準曲線Table 3 The standard curves of different organic acids

表4 杜仲葉超微粉添加量對植物乳桿菌發酵蘋果汁有機酸含量的影響Table 4 Effect of the addition amount of SPEL on the content of organic acids in fermented apple juice

由表4可知，添加SPEL的蘋果汁在發酵過程中甲酸、酒石酸、乳酸、己酸和抗壞血酸的變化趨勢與對照組相同，質量濃度均有顯著增加(P<0.05)。但是蘋果酸的質量濃度變化不顯著，檸檬酸的質量濃度反而顯著降低，這與對照組的檸檬酸和蘋果酸的質量濃度分別顯著升高和降低(P<0.05)明顯不同。且隨著SPEL添加量的增加，發酵后蘋果汁中的甲酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸和蘋果酸的質量濃度均有顯著增加(P<0.05)，與SPEL添加量呈正相關；而乙酸和檸檬酸的質量濃度均顯著降低，其降低量與SPEL添加量無關(P>0.05)。與對照組相比，發酵48 h后的3% SPEL組，甲酸、酒石酸、抗壞血酸和乳酸質量濃度分別增加了53.19%、116.94%、255.18%、31.06%；蘋果酸的質量濃度增加了98.48 mg/L；而乙酸和檸檬酸的質量濃度分別降低了47.40%和90.20%。其中甲酸、酒石酸、乳酸和抗壞血酸的質量濃度增加是因為SPEL為植物乳桿菌提供了更多的發酵底物[33]；蘋果酸的質量濃度變化不明顯，可能是SPEL中某種物質被植物乳桿菌轉化成蘋果酸；乙酸的質量濃度降低，可能是因為SPEL含有的某種功能因子促進了植物乳桿菌快速增殖，使得乙酸含量降低的時間點由36 h提前到24 h；檸檬酸的質量濃度降低，可能是因為添加SPEL促進了檸檬酸的分解或者抑制了丙酮酸的代謝，從而導致檸檬酸的含量不斷降低[34]。

2.7 SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁香氣的影響

由圖5中A可知，發酵48 h后，與對照組相比，W1S(烴類物質)、W2S(醇類物質)、W1W(無機硫化物)、W2W(芳香物質和有機硫化物)4個傳感器所對應的響應值較強，這與郭玉如的研究結果一致[35]。由香氣響應雷達圖(見圖5中A)可知，對照組的揮發性氣味最弱，隨著SPEL添加量的增加，揮發性氣味有所增強，3% SPEL組的揮發性氣味相對較強。為了更直觀地反映添加SPEL對植物乳桿菌發酵蘋果汁香氣的影響，對試驗數據進行PCA和 Loading分析。

圖5 杜仲葉超微粉對發酵蘋果汁香氣響應雷達圖(A)、揮發性風味物質載荷分析(B)和主成分分析(C)的影響Fig.5 Effects of SPEL on aroma response radar diagram (A),volatile flavor substance loading analysis (B) and principal component analysis (C) of fermented apple juice

由圖5中B可知，添加不同SPEL的主成分1(PC1，78.74%)和主成分2(PC2，20.80%)貢獻率之和為99.54%，涵蓋了樣品的大部分原始信息[36]。其中W1S、W2S對第一主成分的貢獻率最大，W1W對第二主成分的貢獻率最大，這和香氣雷達圖結果是一致的。由圖5中C可知，發酵前后添加SPEL組和對照組相比，各組圖形都被很好地分開，說明添加SPEL能夠改變發酵蘋果汁的風味。從第一主成分上來看，對照組發酵前后PC1橫軸坐標基本上不變，而添加SPEL組的PC1橫軸坐標整體向右移動，且隨著SPEL添加量的增加，PC1軸的變化量變小，表明發酵后1% SPEL組對發酵蘋果汁的揮發性香氣成分影響最大，但從橫坐標上貢獻率來看，3% SPEL組的揮發性物質含量更高，具有更好的風味。

3 結論

添加SPEL能夠顯著提高發酵蘋果汁中的pH。

添加SPEL能夠顯著提高發酵蘋果汁的功能性成分含量。發酵后蘋果汁中還原糖、總酚、黃酮含量以及甲酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸和蘋果酸5種有機酸的含量均顯著高于對照組。

添加SPEL能夠顯著改善蘋果汁的色澤和風味。