幾種抗氧化劑和抗氧化增效劑對防止水溶性大蒜油氧化的應(yīng)用研究

陳耀，王暉，王益友，王云霄，甘小平*，呂獻(xiàn)海*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，合肥 230036；2.安徽凱博生物科技有限公司，合肥 230071)

大蒜(garlic)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物的地下鱗莖[1]。大蒜中含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，還含有脂質(zhì)、礦物質(zhì)等[2]。研究表明，大蒜具有天然的去自由基功能和良好的殺菌效果，與茶葉中的茶多酚和玫瑰中的花青素相似，大蒜中的大蒜素及其酶解產(chǎn)物具有抗氧化功能[3]，能幫助清除體內(nèi)各種自由基[4-5]。大蒜中提取的多組分硫醚化合物對真菌有抑制和殺滅作用，是天然高效的抗菌產(chǎn)品[6]。

從新鮮大蒜中提取的大蒜油是具有濃郁蒜香味的食品添加劑[7]，該食品添加劑在食品加工中經(jīng)500倍及以上稀釋后在深加工產(chǎn)品中仍會(huì)帶來純正的蒜香味，在國內(nèi)外食品工業(yè)中應(yīng)用前景廣闊。我國與歐盟、俄羅斯、東南亞等國家和地區(qū)食品加工行業(yè)對水溶性大蒜油均有較大需求[8-9]。目前，大蒜精油的提取工藝主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、超臨界流體萃取法等[10-11]。本文研究的食品添加劑水溶性大蒜油(后文用大蒜油代替)是由安徽凱博生物科技有限公司經(jīng)水蒸氣蒸餾法制備的大蒜精油，與各組分乳化劑和食用酒精按一定比例混合制得[12]。該大蒜油中主要成分為二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基一硫醚、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基二硫醚和二甲基三硫醚等[13]，在室溫陰涼處避光條件下可以儲(chǔ)存較長時(shí)間，但受到較高溫度儲(chǔ)存條件影響后，會(huì)產(chǎn)生氧化褐變，在食品深加工產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用受到很大限制[14]。因此，本文提出用抗氧化劑和抗氧化增效劑的復(fù)配增效來解決水溶性大蒜油容易氧化褐變的思路[15]。

添加抗氧化劑和抗氧化增效劑為目前抑制水溶性大蒜油氧化的有效方式[16]。抗氧化劑是食品工業(yè)中經(jīng)常使用的物質(zhì)，用于生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售中保護(hù)油脂性產(chǎn)品免受環(huán)境氧化，延長油脂性產(chǎn)品的保質(zhì)期[17]。但不同抗氧化劑對不同底物的抗氧化性能仍存在較大的差異性和局限性，且目前抗氧化劑大多單獨(dú)使用，不同抗氧化劑的復(fù)配增效技術(shù)研究較少，專門在大蒜油中應(yīng)用的配方少見文獻(xiàn)報(bào)道，如何提升現(xiàn)有抗氧化劑的功效已成為亟待解決的問題。本文選用8種天然抗氧化劑及2種抗氧化增效劑為研究對象，通過多次優(yōu)化篩選協(xié)同性能最佳的抗氧化劑組合，系統(tǒng)探討該組合抑制大蒜油氧化的作用效果，并借助GC-MS檢測技術(shù)深入解析其協(xié)同抑制大蒜油氧化的作用機(jī)理[18-19]，為水溶性大蒜油的長效儲(chǔ)存提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大蒜精油(安徽凱博生物科技有限公司)、吐溫20、司盤20、食用酒精、玻璃瓶(50 mL)等材質(zhì)包裝材料、丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、茶多酚(TP)、N-苯乙?；?L-谷氨酰胺(PG)、D-異抗壞血酸(AA)、L-抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)、植酸(IP6)、硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)、檸檬酸(CA)等。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；懸臂式恒速攪拌器 常州國宇儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 安捷倫科技(中國)有限公司；阿貝折光儀 上海申光儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單組分抗氧化劑的初篩

設(shè)計(jì)單組分抗氧化劑實(shí)驗(yàn)組與空白組的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的抗氧化劑溶解于食用酒精后可用攪拌器充分?jǐn)嚢枞芙猓?jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將不加抗氧化劑及加不同抗氧化劑的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設(shè)定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時(shí)間取樣觀察并測定，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.2 抗氧化劑二元復(fù)配和三元復(fù)配工藝篩選

根據(jù)單組分抗氧化劑初篩的結(jié)果，設(shè)計(jì)抗氧化效果優(yōu)良的抗氧化劑二元復(fù)配和三元復(fù)配實(shí)驗(yàn)組與空白組的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的多種抗氧化劑溶解于食用酒精后用攪拌器充分?jǐn)嚢枞芙猓?jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將加入不同復(fù)配工藝抗氧化劑的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設(shè)定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時(shí)間取樣觀察并測定，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.3 抗氧化劑與抗氧化增效劑復(fù)配工藝復(fù)篩

根據(jù)抗氧化劑二元復(fù)配和三元復(fù)配工藝篩選的結(jié)果，設(shè)計(jì)抗氧化效果優(yōu)良的二元復(fù)配或三元復(fù)配實(shí)驗(yàn)組與抗氧化增效劑復(fù)配的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的多種抗氧化劑和抗氧化增效劑溶解于食用酒精后用攪拌器充分?jǐn)嚢枞芙猓?jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑和抗氧化增效劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑和抗氧化增效劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將加入二元復(fù)配和三元復(fù)配實(shí)驗(yàn)組與抗氧化增效劑復(fù)配的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設(shè)定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時(shí)間取樣觀察并測定，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.4 加速實(shí)驗(yàn)法(貨架期預(yù)測)

大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間受溫度的影響很大，在低溫保存時(shí)產(chǎn)品品質(zhì)可在較長時(shí)間內(nèi)不變，在溫度較高的條件下大蒜油氧化褐變較迅速。大蒜油的常規(guī)儲(chǔ)存條件為室溫避光保存，若以此條件探究其氧化誘導(dǎo)時(shí)間，會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間，探究的效率會(huì)大大降低，為了解決這一問題，加速實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于放大產(chǎn)品缺陷，縮短大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間，將所得數(shù)據(jù)經(jīng)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式外推，就可以估計(jì)常規(guī)儲(chǔ)存條件下貨架壽命，本實(shí)驗(yàn)過程中溫度均采用偏高于常溫的37 ℃。

根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式，常規(guī)儲(chǔ)存條件的溫度約為20 ℃，每升高10 ℃，反應(yīng)速度升高1倍，即:

K(T+10 ℃)/K(T)=2。

式中：K為反應(yīng)速度常數(shù)。而反應(yīng)速度常數(shù)與食品貨架壽命成反比，因此有：

N(T)/N(T+10 ℃)=2。

式中：N為食品貨架壽命。

可知溫度越高，反應(yīng)速度常數(shù)越大，食品貨架壽命越短，呈指數(shù)相關(guān)。

1.3.5 感官要求和理化指標(biāo)的測定

理化指標(biāo)要滿足GB 1886.272-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 大蒜油》的要求[20]，食品添加劑水溶性大蒜油的感官要求和理化指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。

表1 水溶性大蒜油感官要求和理化指標(biāo)Table 1 Sensory requirements and physicochemical indexes of water-soluble garlic oil

目測法是將試樣置于比色管內(nèi),在光照條件下，可用目測法觀察大蒜油的色澤并和潘通色卡3 517 U色段比較，當(dāng)飽和度低于3 517 U色段時(shí)，說明大蒜油的感官性狀良好，當(dāng)飽和度大于或等于3 517 U色段時(shí)，說明大蒜油已完全氧化。

過氧化值的測定應(yīng)避免在陽光直射下進(jìn)行，將待測樣置于錐形瓶中，加入適量三氯甲烷與冰乙酸的混合液，輕輕振搖使試樣完全溶解。然后加入飽和碘化鉀溶液，經(jīng)處理后搖勻，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定至淡黃色時(shí)加少量淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并強(qiáng)烈振搖至溶液藍(lán)色消失為終點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，平行3組。

折光指數(shù)可用阿貝折光儀測定，根據(jù)折射定律，先用標(biāo)準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)折光儀后，滴入1滴待測樣于阿貝折光儀玻片上，調(diào)節(jié)旋鈕至目鏡顯示出一條明顯的棱線，此時(shí)記錄讀數(shù)為待測樣的折光指數(shù)，使用時(shí)注意鏡面衛(wèi)生。

1.3.6 水溶性大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)檢測

色譜條件：計(jì)算方法：歸一法；定量基準(zhǔn)：面積；柱箱溫度：程序升溫，見表2。進(jìn)樣器溫度：200 ℃；載氣類型：氦氣；分流時(shí)間：1 min；不分流時(shí)間：5 min；FID溫度：245 ℃；輔助爐溫度：50 ℃；分流比：1∶80；計(jì)算周期：17 min。按以上條件測量大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜。

表2 柱箱升溫程序Table 2 Column box heating program

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間

由圖1可知，大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間由過氧化值、折光指數(shù)、感官性狀3個(gè)指標(biāo)中最先達(dá)到國標(biāo)要求的最大限定值決定。具體要求分別是過氧化值小于0.1，折光率在1.550～1.590的范圍內(nèi)，目測顏色為黃色至橘紅色。

圖1 水溶性大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響因素Fig.1 Influencing factors of the oxidation induction time of water-soluble garlic oil

選擇8種抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ、TP、PG、AA、AP、IP6。測定大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的3個(gè)影響因素?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算平行3組的平均值，分別得到對大蒜油抗氧化效果的研究結(jié)果，見圖2。

圖2 單組分抗氧化劑實(shí)驗(yàn)組與空白組的水溶性大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間Fig.2 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in single component antioxidant experimental groups and blank group

由圖2可知，蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間為13 d，各抗氧化劑均能延長其氧化誘導(dǎo)時(shí)間，抗氧化效果由大到小為TBHQ>AP>PG>AA>IP6>BHT>TP>BHA>CK，其中效果最好的TBHQ將氧化誘導(dǎo)時(shí)間延長2倍，PG、AP、AA效果均良好。

將圖2中效果最好的TBHQ與效果較好的PG、AP、AA進(jìn)行二元復(fù)配和三元復(fù)配，測定大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的3個(gè)影響因素?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算平行3組的平均值，得到加入二元復(fù)配和三元復(fù)配抗氧化劑實(shí)驗(yàn)組與空白組的大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間，見圖3。

圖3 復(fù)配抗氧化劑實(shí)驗(yàn)組與空白組的水溶性大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間Fig.3 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in compound antioxidant experimental groups and blank group

由圖3可知，抗氧化劑間分別存在協(xié)同作用和拮抗作用，抗氧化效果由大到小為TBHQ+AP=TBHQ+AP+AA>TBHQ+PG+AP>TBHQ+PG+AA>TBHQ+AA>TBHQ>TBHQ+PG>CK，其中效果最好的TBHQ+AP和TBHQ+AP+AA實(shí)驗(yàn)組均將氧化誘導(dǎo)時(shí)間延長2.8倍，TBHQ+PG實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出拮抗作用，其余實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出協(xié)同作用，將同一復(fù)配組合相互作用，計(jì)算所得復(fù)配組合之間的SYN 值，即協(xié)同或拮抗率：

SYN=(N-N0)/N×100%。

按以上SYN 值的計(jì)算公式，不同抗氧化劑間復(fù)配后對大蒜油抗氧化作用效果為TBHQ+AP(SYN：42.31%)、TBHQ+AA(SYN：11.54%)、TBHQ+PG+AP(SYN：30.77%)、TBHQ+PG+AA(SYN：15.38%)、TBHQ+AP+AA(SYN：42.31%),5個(gè)組合在對大蒜油抗氧化作用效果具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。對比TBHQ與其他抗氧化劑組合的結(jié)果時(shí)，有明顯的協(xié)同效應(yīng)，而組合TBHQ+PG(SYN：-3.85%)顯示拮抗作用。該結(jié)果表明抗氧化劑的協(xié)同或拮抗作用不是由一種抗氧化劑主導(dǎo)，而是受到抗氧化劑或抗氧化劑與產(chǎn)品共同作用，如相互反應(yīng)、作用機(jī)理不一致等多種因素影響。在食品工業(yè)中，食品生產(chǎn)加工應(yīng)當(dāng)盡可能少用或者不用食品添加劑，因此TBHQ+AP實(shí)驗(yàn)組為最好的復(fù)配工藝。

將圖3中效果最好的TBHQ+AP復(fù)配工藝分別與抗氧化增效劑硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)、檸檬酸(CA)復(fù)配，測定大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的3個(gè)影響因素?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算平行3組的平均值，得到抗氧化劑與抗氧化增效劑復(fù)配工藝，見圖4。

圖4 抗氧化劑與抗氧化增效劑復(fù)配工藝組與空白組水溶性大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間Fig.4 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in the compound process groups of antioxidant and antioxidation synergistic agents and blank group

由圖4可知，抗氧化增效劑能有效延長大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間，抗氧化效果由大到小為TBHQ+AP+DLTP>TBHQ+AP+CA>TBHQ+AP>TBHQ>CK。其中效果最好的TBHQ+AP+DLTP實(shí)驗(yàn)組將氧化誘導(dǎo)時(shí)間延長3.5倍，叔丁基對苯二酚(TBHQ)+L-抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)+硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)是最佳的復(fù)配工藝。

2.2 水溶性大蒜油的感官要求和理化指標(biāo)測定結(jié)果

TBHQ+AP+DLTP復(fù)配工藝水溶性大蒜油的感官要求和理化指標(biāo)測定結(jié)果見圖5，達(dá)到3 517 U臨界色段時(shí)(第45天)大蒜油的過氧化值始終為0，折光率始終保持在1.550～1.590，說明感官性狀是判斷大蒜油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的先決條件。此數(shù)據(jù)也間接印證了大蒜油是天然的抗氧化劑，即使在感官性狀不良的狀態(tài)下，其本身的組分經(jīng)檢驗(yàn)依然滿足過氧化值和折光指數(shù)的要求，且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，橘紅色水溶性大蒜油依然澄清，且經(jīng)過稀釋后顏色會(huì)變淺。

圖5 水溶性大蒜油的過氧化值、折光系數(shù)、感官性狀Fig.5 Peroxide value,refraction coefficient and sensory properties of water-soluble garlic oil

2.3 水溶性大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測結(jié)果

按上述色譜條件，測定大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜。大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜圖見圖6。

圖6 新制的大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.6 GC-MS diagram of newly prepared garlic oil

對圖6進(jìn)行積分計(jì)算整理，得到水溶性大蒜油的主要組成成分和所占比例，見表3。

表3 水溶性大蒜油的主要組成成分和所占比例Table 3 Main components and their proportions of water-soluble garlic oil

續(xù) 表

由表3可知，大蒜油中最主要的6種硫醚化合物占大蒜油的95%，而植物油主要由油酸和亞油酸組成，可見大蒜油與其他植物油的成分差異很大。

2.4 貨架期預(yù)測結(jié)果

根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式，常規(guī)儲(chǔ)存條件的溫度為20 ℃，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱控制37 ℃下的速率為20 ℃下的21.7倍，使用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱控制37 ℃下加速實(shí)驗(yàn)法的1 d大約相當(dāng)于20 ℃下貯藏3.25 d，大蒜油在37 ℃條件下氧化誘導(dǎo)時(shí)間為13 d，根據(jù)加速實(shí)驗(yàn)的貯藏時(shí)間可外推得到20 ℃下油品最佳貯藏時(shí)間為42 d。TBHQ+AP+DLTP最佳復(fù)配工藝的水溶性大蒜油在37 ℃條件下氧化誘導(dǎo)時(shí)間為45 d，根據(jù)加速實(shí)驗(yàn)的貯藏時(shí)間可外推得到20 ℃下大蒜油最佳貯藏時(shí)間為146 d。

3 結(jié)論

本文以水溶性大蒜油為研究對象，利用8種抗氧化劑和2種抗氧化增效劑進(jìn)行抗氧化復(fù)配，經(jīng)多次篩選得到協(xié)同作用最好的復(fù)配工藝為TBHQ+AP+DLTP。該組合對水溶性大蒜油氧化穩(wěn)定性具有較好的協(xié)同作用。三者產(chǎn)生協(xié)同作用主要是因?yàn)樵诙嘟M分硫醚氧化的過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，經(jīng)GC-MS判斷，新鮮大蒜提取的大蒜油中主要成分為硫醚化合物。為高效研究水溶性大蒜油穩(wěn)定性配方，將已知的抗氧化劑分別添加在大蒜油中，篩選出性能較好的抗氧化劑TBHQ為主要抗氧化成分，然后將TBHQ與PG、AP、AA進(jìn)行二元復(fù)配和三元復(fù)配，篩選出協(xié)同性能高的抗氧化復(fù)配組合，并優(yōu)化其配方比例；通過比較氧化誘導(dǎo)時(shí)間得到最佳的復(fù)配工藝。依據(jù)過氧化值、折光指數(shù)、感官性狀3個(gè)指標(biāo)得到大蒜油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間，說明該產(chǎn)品被認(rèn)定為氧化變質(zhì)只是因?yàn)楦泄傩誀畈槐蝗私邮埽词乖诟泄傩誀畈涣嫉臓顟B(tài)下，其本身的組分經(jīng)檢驗(yàn)依然滿足過氧化值和折光指數(shù)的要求，此研究結(jié)果也說明大蒜油是天然的抗氧化劑。且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，橘紅色水溶性大蒜油依然澄清透明，且經(jīng)過稀釋后會(huì)恢復(fù)澄清的淺黃色液態(tài)。為日后水溶性大蒜油的生產(chǎn)、儲(chǔ)存提供了新的探究思路，即是否可以將感官性狀不良的高濃度大蒜油稀釋成顏色可接受的低濃度大蒜油繼續(xù)使用。

本文在初篩抗氧化劑前，期望較大的是對大多數(shù)油脂類植物油抗氧化效果均有良好表現(xiàn)的BHT、BHA等，后來發(fā)現(xiàn)BHT、BHA的效果一般，原因可能是BHT、BHA是作用于高溫油脂類抗氧化劑，通過GC-MS可以看出，經(jīng)新鮮大蒜提取的大蒜油中主要成分為硫醚化合物，可見大蒜油與其他油脂性食品的成分差異很大。我們也發(fā)現(xiàn)水溶性大蒜油中氧化劑發(fā)揮作用時(shí)，產(chǎn)品的性狀變化較緩慢，當(dāng)水溶性大蒜油開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象后，會(huì)迅速加快褐化成橘紅色。水溶性大蒜油的氧化是一個(gè)復(fù)雜的過程，亦會(huì)產(chǎn)生諸多副反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)對這些副反應(yīng)進(jìn)行后續(xù)探討。