益氣排毒方對慢性腎臟病大鼠腎臟病理的影響*

李玉靖，鄭壁偉，歐陽永紅△

(1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518000；2.廣州中醫藥大學附屬清遠市中醫院，廣東 清遠 511500)

慢性腎臟病又稱慢性腎衰竭，是指各種因素所致的病程不少于3個月的腎臟損害和(或)GFR降低。其中，GFR是慢性腎臟病的分期的主要依據；而腎臟損害包括腎臟結構或功能異常，病理形態學改變是腎臟結構異常的重要表現，對腎臟診斷及治療具有指導意義。益氣排毒方是廣東省名中醫歐陽永紅教授40余年臨證經驗的總結，臨床運用于慢性腎臟病患者，在緩解患者臨床癥狀、改善腎臟功能的理化指標等方面效果顯著。歐陽教授師承團隊已對該方在動物實驗研究中緩解臨床表現和改善理化指標方面療效進行了總結和歸納[1]。本論文將通過對實驗動物進行解剖及腎臟組織病理觀察，進一步證實益氣排毒方對慢性腎臟病大鼠的腎臟損害具有改善作用，可延緩和抑制病程進展，初步探討益氣排毒方對慢性腎臟病的作用機制，研究討論益氣排毒方組方，為臨床推廣應用提供實驗研究和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源廣州中醫藥大學實驗動物中心，SPF級wistar大鼠24只，雌雄各半，體重(200±20)g。

1.1.2 藥物 (1)造模藥物：維生素B4(即腺嘌呤)，上海延安萬象藥業生產，每片10 mg。(2)益氣排毒方：黃芪20 g，淫羊藿10 g，茯苓15 g，白術12 g，黃精10 g，枳實10 g，丹參20 g，大黃10 g(后下)、煅牡蠣20 g，白花蛇舌草10 g，以蒸餾水500 mL浸泡至少半小時后，慢火濃煎至200 mL(由清遠市中醫院藥學部中藥制劑室統一提供)。

1.2 方法

1.2.1 造模采用“腺嘌呤毒害大鼠腎臟”建立慢性腎臟病模型，即隨機選取實驗大鼠21只，做好標示，用蒸餾水將維生素B4配制成2%的溶液，先以200 mg/kg/d給藥量灌胃，連續給藥2周；再以100 mg/kg/d的劑量，連續給藥1周。隨機抽取造模大鼠1只與正常大鼠1只，心臟取血，標本送清遠市中醫院檢驗中心檢測腎功能指標，將之處死，分別解剖并觀察大鼠腎臟病理，保證造模成功。

1.2.2 分組按重量使用隨機數字表法，將慢性腎臟病模型大鼠隨機分為：干預組10只(191.26±5.71 g)、對照組10只(188.76±6.81 g)，2組大鼠體重無統計學差異(t=0.8899<2.086，P>0.05)。正常組大鼠給予正常喂養，作為最終參照，證明慢性腎臟病大鼠模型成功。

1.2.3 給藥 干預組按正常成人體重劑量14倍給藥，經換算為23.38 mL/kg，即平均每只大鼠灌入中藥煎劑約4 mL，連續喂養28 d，1天1次。對照組大鼠灌入等量(23.38 mL/kg)蒸餾水。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 腎臟大體觀察 給藥28 d后處死所有大鼠，摘取腎臟，洗凈淤血塊，剔除周圍脂肪和筋膜組織，吸干腎臟表面水分，稱取單腎的重量，算出腎重/體重比值。用生理鹽水重新清洗大鼠腎臟，肉眼觀察臟器外觀(包括大小、色澤、質地、包膜、皮質、髓質、實質等)并做好記錄，其后分別浸泡在裝有福爾馬林的標本瓶中待切片。

1.2.4.2 病理觀察 石蠟切片制作方法：腎活檢組織經固定(10%甲醛)、脫水(無水乙醇)、石蠟包埋、切片(厚度1.5 μm)、HE染色。

1.2.5 觀察內容 (1)腎小球：病理損害程度，包括腎小球增生、萎縮、纖維化等。(2)腎小管：病理改變情況，包括腎小球擴張、阻塞，上皮細胞變性、脫落、壞死等。(3)腎間質：病理改變情況，包括炎性細胞浸潤、間質纖維化等。

2 結果

2.1 基本情況 對照組共10只，死亡2只(第14 d、第18 d)，存活8只(80%)；干預組共10只，死亡1只(第20天)，存活9只(90%)；正常大鼠共10只，死亡0只，存活10只(100%)。肉眼觀察，正常大鼠精神狀態、毛發色澤、生存情況等明顯好于2組慢性腎臟病大鼠；2組比較，干預組優于對照組。

2.2 對腎重體重比的影響 見表1，圖1。

表1 2組大鼠實驗后腎重/體重比×103 比較情況

正常大鼠(HE×200)

對照組(HE×200)

干預組(HE×200)圖1 3組大鼠HE染色腎臟病理變化

慢性腎臟病模型大鼠，均出現腎臟腫脹變大，腎重/體重比值高于正常大鼠。根據2組比較結果，說明益氣排毒方可有效減輕腎組織增生情況，延緩腎臟損害進度。

2.3 腎臟大體觀察情況 與模型組對比，干預組腎臟表面顏色較深，整體腫脹情況、薄膜增厚程度較輕，說明該方具有保護腎功能的作用。見表2。

表2 腎臟大體觀察情況

2.4 HE染色腎臟病理觀察

2.4.1 HE染色觀察 對照組腎臟組織損害嚴重，腎小管擴張，部分腎小管堵塞，大量腎小管上皮細胞脫落，內有大量結晶體沉積。與對照組相比，干預組病理損害較輕，部分腎小管擴張，少量腎小管上皮細胞脫落，管內少量結晶沉積。

2.4.2 對照組 腎小管明顯擴張，大量腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落，管腔內見大量深黃色結晶體，甚者完全堵塞；腎小球數量明顯減少，部分出現萎縮、塌陷，腎小囊腔內見炎性細胞浸潤，部分腎小球球囊擴張，囊壁增厚；腎間質纖維化，可見炎性細胞、深黃色結晶體。

2.4.3 干預組 腎小管輕-中度擴張；腎小球數量有所減少，少量萎縮或塌陷，球內系膜細胞增生不明顯；腎間質纖維化程度較對照組輕，內少量金黃色結晶。

3 討論

3.1 慢性腎臟病大鼠造模方法主要有3種：化學法、物理法和生物法。許亞超等[2]對比研究3種造模方法，顯示采用化學法造模成功率和存活率最高；在癥狀體征、腎功能指標和腎臟病理等方面，其嚴重程度較其他兩種方法嚴重?；瘜W藥物造模法常用藥物包括有腺嘌呤和阿霉素等[3]。本研究采用的是腺嘌呤(即維生素B4)，通過給實驗大鼠灌入大量腺嘌呤，在氧化酶作用下轉化為2，8-二羥基腺嘌呤，由于2，8-二羥基腺嘌呤為極難溶于水的結晶體，其隨血液輸送至腎臟，沉積于腎皮質、髓質等部位，并阻塞腎小管，引起腎臟纖維組織增生、免疫炎癥反應等，最終導致腎功能損傷[4]。其中，腎間質纖維化、炎癥反應是腺嘌呤造模的重要病理改變。通過觀察這些病理改變的相關逆變化，則可證明治療的有效性。

在2組實驗大鼠的腎臟病理比較中，干預組在腎組織損害程度、纖維化、晶體沉積等各方面均明顯輕于對照組，表明益氣排毒方具有減小腺嘌呤的腎毒性，減少結晶體沉積和腎小管堵塞，延緩腎小管變性，抑制系膜細胞增生，抗腎臟組織纖維化，減輕炎癥反應等作用。本研究從病理學層面，進一步證實益氣排毒方具有改善實驗大鼠一般狀況，提高生存質量；改善微循環，加快毒素排出，減少其在體內蓄積，降低血肌酐、尿素氮等指標；調節鈣磷代謝，促進紅細胞生成，維持血紅蛋白水平等功能。

3.2 歐陽教授研讀大量中醫古文獻，吸收現代中醫藥研究，結合臨床實踐所得，對“腎為先天之本，脾為后天之本”非常認同，認為腎脾兩臟是治療腎系疾病的關鍵所在。腎為元陰元陽之所在，具有溫熙的功能，與腎之腑膀胱相合，主氣化；脾主運化，與脾之腑胃相合，共奏升清降濁之功；兩臟可謂是人體生命活動的原動力。脾腎虧虛，則機體運化、溫煦功能減退，營衛失調，衛氣不能固護肌表而易受外邪，營陰氣化不力而內生水濕痰飲。水濕痰飲為陰邪，愈傷陽氣，阻礙氣機，氣不行則血不暢，瘀血乃生。病久病甚則開合失司，當瀉不瀉，污穢難排，毒素內積，成為“溺毒”等疾。歐陽教授對“久病必瘀”理論十分推崇，強調慢性腎臟病病情纏綿，必兼瘀血。他認為，慢性腎臟病病機就為本虛標實，本虛以脾腎虧虛為甚，標實則有水濕、痰飲、毒邪、瘀血等，治宜以“補不足”“損有余”“攻補兼施”為則，確立了“補益脾腎、祛瘀排毒”的治法，強調活血化瘀應貫穿疾病始終，由此創立了益氣排毒方。

3.3 益氣排毒方作為歐陽教授40余年慢性腎臟病臨證經驗升華的產物，在臨床中取得良好療效，得到廣泛肯定。該方由黃芪、淫羊藿、黃精、茯苓、白術、大黃、枳實、丹參、煅牡蠣、白花蛇舌草組成，標本兼治，攻補兼施，予攻于補。方中以黃芪、淫羊藿、黃精、白術、茯苓等補益脾胃、益氣養陰、滲濕利水；大黃、丹參、枳實、煅牡蠣、白花蛇舌草攻邪排毒、活血逐瘀。

3.3.1 君藥：黃芪、淫羊藿。

黃芪，性溫味甘，歸脾肺兩經，具有益氣升陽、利水消腫、托瘡生肌之效，《本草綱目》謂其：“補諸虛不足，益元氣，壯脾胃”。值得注意的是，此方選用黃芪，而非人參。與大補元氣之人參相比，黃芪較為溫和，慢性腎臟病者久病體虛，難受峻補，且黃芪具有固表利水之功，取“提壺揭蓋”之寓。夏平等[5]通過對基于“腎虛濕瘀”理論治療慢性腎臟病的相關數據進行分析，有關黃芪研究文獻高居第一位，說明黃芪對慢性腎臟病具有良好療效已是臨床和科研的共識。現代藥理研究中，胡營杰等[6]研究說明黃芪有效成分可抑制實驗大鼠腎小球系膜細胞中表達血小板源性生長因子(PDGF-BB)mRNA及蛋白的表達，從而改善或延緩腎小球硬化。陳偉等[7]發現黃芪多糖能夠均有抗氧化抗炎作用，可減輕腎小管上皮細胞炎癥反應；韓鵬勛等[8]研究表明黃芪甲苷可能通過抑制信號通路活化起到腎臟保護作用。傅天嘯等[9]認為黃芪注射液可減輕糖尿病腎病大鼠蛋白尿，降低血清脂聯素、抑制腎組織脂聯素蛋白及mRNA表達，降低炎癥因子水平，延緩腎臟病理損害。

淫羊藿，又名仙靈脾等，性溫味辛甘，歸肝腎兩經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，是臨床中常用的壯陽藥。首載于《神農本草經》，屬中品無毒，“主陰萎絕傷”兼有“利小便”之功。李時珍糾正其性“溫而不寒”，強調其能“益精氣”，“真陽不足者宜之”。淫羊藿對慢性腎臟病療效明顯，并引起廣泛關注。在統計數據分析中，有關淫羊藿研究文獻數量居補陽藥中第二位[5]。趙錦等[10]認為淫羊藿苷對實驗大鼠可降低氧化應激水平、減輕炎癥反應，抑制細胞外基質增生和腎組織細胞凋亡。張紅等[11]研究認為，淫羊藿苷對IgA腎病大鼠通過調控NF-κBp65、MCP-1因子的表達以及機體免疫調節等途徑，實現腎臟保護作用。人腎皮質近曲小管上皮細胞(HK-2)體外實驗顯示，淫羊藿苷可促進HK-2細胞增殖，抑制纖維連接蛋白mRNA及蛋白表達，發揮抗TGF-β1誘導的HK-2細胞向成纖維細胞轉化的作用[12]。

3.3.2 臣藥：黃精、白術、茯苓。

黃精，又稱老虎姜，性味甘平，有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效。清遠連州盛產此藥，當地人常以泡制“黃精酒”，補而不燥，潤而不膩。歐陽教授在清遠從醫數十年，對此藥頗有心得，認為其擅滋腎陰，將之與淫羊藿相配，寓意“陰中求陽”?，F代研究表明，黃精化學成分復雜，主要有多糖、皂苷、黃酮等，具有降糖、護腎、抗老年癡呆等藥理作用。陳宇等[13]整理分析，黃精通過抗腎間質纖維化、抗炎、抗氧化應激等多重作用機制，發揮保護腎臟的作用。彭靜等[14]研究表明黃精皂苷可以抑制腎小管間質纖維化進程，保護腎臟。白術、茯苓是健脾滲濕利水的經典藥對。白術甘溫苦燥，擅于守中；茯苓甘淡滲濕，長于下行。兩藥為伍，不溫不燥，一補一滲，守中有通，相須為用，相得益彰。白術、茯苓與黃芪相配伍，還寓有健脾補氣經典方四君子之意。在兩藥相關研究文獻數量統計中，白術在補氣藥中居第二位，茯苓在利水藥中居首位[5]。鄭曉珂等[15]研究認為，白術注射液通過增強抗氧化酶抗氧化，白術多糖能改善腎臟濾過屏障泌尿功能和腎小管重吸收功能。白術還能改善陽虛型慢性腎臟病大鼠的環核苷酸水平，降低肌酐、尿素氮等，減輕蛋白尿[16]。李佳丹等[17]研究認為，茯苓多糖可抑制實驗小鼠p38MAPK磷酸化，激活PPAR-γ通道，從而改善腎臟損傷。另外，茯苓具有減輕腎小管上皮細胞間充質轉分化和細胞外基質在間質區域過度沉積的作用[18]。

3.3.3 佐使藥：大黃、枳實、丹參、白花蛇舌草、煅牡蠣均為方中佐使，則重攻邪排毒，活血祛瘀，滲濕利水等功效。大黃、枳實，取義于經方小承氣湯，攻下排毒降濁，促進邪毒從后陰排出。孫蔣研等[19]研究發現大黃素對AKI大鼠腸道菌群失衡有一定的調節作用，這可能是其治療腎損傷的作用機制之一。白亞君等[20]研究表明大黃酚能調節腎臟免疫反應，減輕腎損傷。焦士蓉等[21]研究發現枳實提取物能有效清除多種自由基，起抗氧化作用。丹參集活血補血涼血于一身，古有“一味丹參，功同四物”之說。曹春芽等[22]認為丹參提取物可降低血清尿素氮、肌酐水平，改善腎組織病理狀態。陳莎莎等[23]認為丹參酮ⅡA可通過降低氧化應激水平、抗炎、減少細胞凋亡、減輕細胞外基質沉積、改善腎間質微循環、保護血管內皮細胞、阻斷細胞信號通路、抑制促纖維化因子的釋放等多重作用保護腎臟。白花蛇舌草，是常用嶺南草藥，具有清熱解毒、滲濕利水之效。鄒寒冰等[24]研究發現白花蛇舌草可抑制人腎癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等。煅牡蠣具有吸附毒素、收斂固澀精微和糾正鈣磷代謝紊亂的作用[25]。

全方配伍嚴謹，標本兼顧，病證并治，療效確切。此次動物實驗研究中，團隊按大鼠體重定量給藥，且限于動物辨證的局限性，維持原方，未予加減；但實際臨證中，應三因制宜，辨證論治，隨癥加減，以達最佳治療效果。