基于數據挖掘和網絡藥理學的痰瘀痹阻型類風濕關節炎的用藥規律及機制分析*

侯 衛，杜時雨，湯小虎△

(1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是常見的自身免疫性疾病，主要臨床表現是對稱性多關節炎，病變關節表現為腫脹、疼痛、僵硬等，最終導致關節畸形和工作障礙等，并可伴有關節外多臟器的損害[1]。我國RA發病率在0.3%～0.6%[2]，可發生于任何年齡，女性發病率是男性2～3倍[3]。RA臨床常用改善病情抗風濕藥、非甾體抗炎藥、生物制劑等，但需長期規范用藥，尚缺乏根治及預防本病的有效措施。

亙古通今，眾多中醫學家致力于RA診治，中醫藥在治療和改善癥狀等方面療效顯著且毒副作用小，目前已成為較為系統的理論、體系。現代研究已經證實RA患者中晚期常出現關節畸形、類風濕結節及合并動脈粥樣硬化、血管炎等，這些與痰瘀瘀阻密切相關，僅采用傳統抗風濕藥、生物制劑等控制RA病情的發展，需長期用藥、易致患者依從性減低、自行停藥、減藥比例明顯提高，因此中醫藥在中晚期RA患者的診治中作用日益增長。本研究通過搜集近20年中醫藥治療痰瘀痹阻型RA的相關醫案、文獻，并運用數據挖掘技術歸納、總結RA痰瘀痹阻證的用藥規律及對藥物組合的潛在作用機制進行探索，為RA的防治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 檢索方法 以“類風濕關節炎”“尪痹”“痰瘀痹阻”“中藥”等為檢索詞，檢索國家知識基礎設施數據庫(簡稱中國知網，CNKI)中收錄的文獻，時間為2000年1月至2020年12月。

1.2 納入標準 (1)中醫診斷為“尪痹-痰瘀痹阻證”，西醫診斷為“類風濕關節炎”，醫案記錄完整。(2)病例采用中醫藥治療，可聯合其他中西醫治療方法，包括病案分析、臨床療效觀察、專家經驗方等。(3)方劑名稱、中藥名稱、用藥劑量明確完整。符合以上3條者，即可納入本研究。

1.3 排除標準 (1)病例診斷不明確，病例重復者(僅納入時間早者)。(2)中藥劑量缺失、方劑重復及組成不完成整者。(3)綜述類文獻。(4)動物實驗。有上述任意一項者，不納入研究。

1.4 中藥規范 為避免處方中以別名、采集、炮制、地區差異等不同，造成藥物分析偏差，參照《中藥學》[4]、《中華人民共和國藥典》[5]對藥物名稱統一規范化，例炙細辛統一為細辛，生地統一為生地黃，元參統一為玄參，生甘草、炙甘草統一規范為甘草等。

1.5 數據分析與處理 將篩選符合納入標準的醫案錄入古今醫案云平臺(V 1.5.7)中醫案采集模塊，該軟件的算法經實踐證實具有科學性、可靠性。錄入過程由兩位研究者共同完成，并對數據進行核查，以確保錄入數據準確可靠。

1.6 作用機制分析 將上述得到的核心藥對輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)檢索化學成分及作用靶點，檢索條件“口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18”，得到有效成分與作用靶點，并對靶點以Uniport數據庫(https：//www.uniprot.org)進行標準化，篩選條件：口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18；在GeneCards數據庫以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞，獲得RA的作用靶點，取RA和藥對的交集靶點輸入STRING數據庫，繪制蛋白互作PPI網絡圖，利用 Cytoscape3.6.0軟件構建核心藥對-活性成分-靶點-RA網絡及篩選核心化合物，對共同靶點進行KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 基于數據挖掘的文獻研究結果

2.1.1 藥物頻次統計 本研究共納入173篇文獻，193張處方，涉及藥味411味藥，總頻次2594次。其中使用頻次以當歸109次，紅花88次，川芎86次，桃仁80次，白芥子73次排名較前，又以當歸的使用頻次最高，頻率約為56.48%。使用頻次前10的藥物見表1。

表1 高頻中藥統計表

2.1.2 藥物功效統計 中藥的藥物功效進行統計，結果以祛風濕、潤腸通便、調經止痛、祛風止痛類排名較前。排名前10的見表2。

表2 中藥功效統計表(排名前10)

2.1.3 藥物藥性藥味統計 對納入的411味中藥進行四氣統計，結果顯示溫性藥使用最多，藥用頻次292次，頻率為33.42%，其次為平、寒，具體結果見圖1；五味統計以辛味藥使用最多，藥用頻次1074次，頻率41.40%，其次為苦、甘、咸，具體見圖2。

圖1 藥物四氣統計

圖2 藥物五味統計

2.1.4 藥物歸經統計 對納入的中藥歸經進行數據統計分析。在411味中藥里，共出現5074次歸經。結果為肝經(1440次，55.51%)，脾經(908次，35.00%)，心經(633次，24.40%)排名較前，具體見圖3。

圖3 藥物歸經統計圖

2.1.5 高頻藥物聚類分析 對193首中藥處方中頻次≥30的高頻藥物進行聚類分析，距離類型為歐式距離，聚類方法為最長距離法，聚類分析結果見圖4。以距離>9進行分組，可將藥物分為5組。第1組：地龍、甘草；第2組：紅花、桃仁、當歸、川芎；第3組：白芥子、全蝎、僵蠶；第4組：威靈仙、桂枝。第5組：白芍、茯苓、陳皮、半夏、黃芪、雞血藤、青風藤、羌活、牛膝、秦艽、沒藥。

圖4 中藥聚類分析圖

2.1.6 高頻中藥關聯分析 運用古今醫案云平臺的數據挖掘中“關聯分析”模塊，以置信度>0.6，支持度>0.3，提升度>1.4為條件，對高頻中藥進行分析，按照支持度高低進行排序，具體見表3。并根據支持度、提升度得到核心藥對：川芎-當歸。

表3 高頻藥物關聯規則分析

2.2 核心藥物組合“川芎-當歸”抗類風濕關節炎的作用機制分析

2.2.1 川芎-當歸的活性成分及對應靶標 從TCMSP中共獲取當歸的化學成分125種，川芎的化學成分189種。篩選出當歸的活性成分2種，川芎的活性成分7種，見表4。同時，在數據庫中獲取川芎-當歸活性成分的對應候選靶標共91個。

表4 川芎-當歸的活性成分

2.2.2 川芎-當歸的活性成分治療RA的潛在作用靶標預測 在Uniprots數據庫中輸入靶標名稱，獲得91個候選靶標的相應基因。將其與GeneCards數據庫檢索到與RA疾病有關的靶基因相映射，用韋恩圖篩選出川芎-當歸治療RA的潛在作用靶標共35個。并導入cytoscape軟件構建藥物-成分-靶點-疾病網絡圖，并給予可視化展示見圖5。根據網絡Degree值結果，位居前三的成分依次為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、楊梅酮(myricanone)、豆甾醇(stigmasterol)等，表明這些化合物是川芎-當歸治療RA的主要活性成分。

圖5 川芎-當歸的關鍵活性成分與疾病靶標的網絡

2.2.3 川芎-當歸治療類風濕關節炎靶點蛋白互作分析 將得到的35個共同靶點基因導入STRING數據庫構建PPI網絡，并利用R軟件選取degree排名前20的靶點繪制條形圖，見圖6，圖中條形柱的長度代表degree的大小，由圖可CASP3、PTGS2、ESR1、JUN等基因排名較前。

圖6 川芎-當歸治療RA可能的關鍵基因

2.2.4 KEGG功能富集分析 通過KEGG分析結果顯示共有96條KEGG代謝通路參與其中，篩選出富集基因數較多的前20條通路，主要涉及脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、p53號信號通路(p53 signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、apoptosis-multiple species(細胞凋亡-多物種)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。見圖7。

圖7 川芎-當歸治療RA潛在作用靶標的GO富集分析

3 討論

查閱古書典籍中并無“類風濕關節炎”這一病名，根據癥狀將其歸為“痹證”“尪痹”等范疇，認為其“正虛”為內在因素，“邪侵”為外在因素。疾病后期往往出現“痰濁”“瘀血”等有形之邪搏結關節，正如《醫級》所云：“痹非三氣，患在痰瘀。”臨床應該加以重視。張金山等[6]研究發現痰瘀痹阻證RA較其它證型病程偏長，且疾病活動和關節病變數目顯著升高。痰瘀痹阻證RA患者的RF、抗CCP等實驗室指標陽性率高于其它證型且骨破壞情況較嚴重[7]。將古今醫案云平臺數據挖掘和網絡藥理學研究方法相結合，深入研究痰瘀痹阻證RA的用藥規律及作用機制，為臨床RA的治療提供參考。

本研究以RA痰瘀痹阻證為研究對象，通過搜集近20年的173篇相關文獻，193個處方，錄入古今醫案云平臺進行數據挖掘、分析，總結出痰瘀痹阻型RA的用藥規律。藥物使用頻率統計得出，具有活血通經、散瘀止痛之效的紅花出現頻率最高，紅花富含紅花黃色素、紅花紅色素、紅花多糖等多種化合成分，具有抗炎、調節免疫、抗缺氧、調節血液形態等多種作用[8]。川芎出現頻率僅次于紅花，其有活血行氣、祛瘀止痛、祛風等功效，如《日華子本草》所言“治一切風，一切氣，一切勞損，一切血，補五勞，壯筋骨”。其主要成分為生物堿、多糖類等，具有抗炎、鎮痛、抗氧化等功效[9]。藥物的歸經主要為祛風濕藥，本質為祛除風寒濕邪，治療風濕痹病，現代研究證實祛風濕藥對細胞免疫、自然殺傷細胞及非特性免疫功能等均具有抑制作用，從而發揮抗炎、鎮痛、免疫抑制等作用[10]。藥物歸經頻率以肝經、脾經為主。

肝主疏泄，維持氣機疏通暢達，保障機體“通而不滯、散而不瘀”，肝氣瘀滯，則影響血運受阻，不通則痛，可見肢體筋骨、肌肉疼痛等癥狀；肝血虧虛，筋骨失濡，可見肢體疼痛、屈伸受限。代雪雙等[11]研究發現《中華醫典》中“痹證”“尪痹”用藥規律中，歸肝經藥物最多，并且治療RA應從肝論治，以疏肝解郁法為主。RA患病日久、痰瘀痹阻，加之長期服藥可影響脾胃功能，臨證更應注重顧護脾胃[12]。在關聯分析中，組合支持度、提升度排名前3依次為“川芎-當歸”“桃仁-紅花”“紅花-當歸”，以上藥物組合大多為活血通絡、化痰行瘀、祛風止痛等功效，與痰瘀痹阻證RA的病因病機相符合。川芎-當歸早在《太平惠民和劑局方》中就有詳細記錄，廣泛存在于四物湯、獨活寄生湯、當歸四逆散、補陽還五湯等方藥中，芎歸配伍可以增強活血止痛、祛瘀通絡等功效。川芎與當歸共有的有效成分為阿魏酸、綠原酸、藁本內酯等，對免疫功能有良好的調節作用。相關研究證實兩者1∶1配伍是抗炎、鎮痛作用最強[13]。

從網絡藥理學分析結果，發現β-谷甾醇(beta-sitosterol)、楊梅酮(myricanone)、豆甾醇(stigmasterol)的Degree值位列前三，說明它們可能是治療RA的關節活性成分。β-谷甾醇和豆甾醇同為植物甾醇，具有抗炎癥、免疫調節等多種生物活性。有研究發現β-谷甾醇可將M1極化骨髓源性巨噬細胞中IL-1β、CD86等分子表達降低，M2中IL-10、CD163等分子表達增加，使M1/M2平衡恢復，減緩類風濕性炎癥表現[14]。楊梅酮的抗炎作用可以與抑制IL-1、IL-6、IL-4等多種炎癥細胞因子的表達相關[15]。通過PPI網絡分析發現，川芎-當歸防治RA的核心Hub基因前三的依次為CASP3、PTGS2、ESR1。滑膜細胞的過度增生、活化和凋亡不及可導致RA的軟骨與骨組織的損傷，而誘導CASP3活化可促進滑膜細胞凋亡、抑制增生，減輕關節RA癥狀[16]。PTGS2是前列腺素生物合成的關鍵酶，對細胞的作用主要體現在保護方面，改善疾病的炎癥反應主要體現在調節PTGS2靶點的水平[17]。ESR1依賴ERK信號通路調控細胞的增殖、自噬和凋亡，促進軟骨發育[18]，還可調控免疫反應及炎癥細胞因子表達[19]。通過KEGG通路富集分析結果，顯示藥物活性成分主要通過炎癥等相關通路發揮調節RA的作用。相關研究表明，“痰瘀互結”是RA與動脈粥樣硬化共病機，痰瘀痹阻證RA患者合并動脈粥樣硬化較其它證型較多[20-21]，炎癥反應加速斑塊不穩定化，同時可以加重炎癥反應。張婷[22]研究發現抑制P53可促進炎癥細胞因子分泌增加，引起滑膜成纖維細胞分泌增加，導致滑膜炎癥和關節破壞。IL-17信號通路在RA病理過程中發揮中藥作用，IL-17為促炎性細胞因子，誘導炎癥因子、趨化因子等，進而激活NF-κB通路，促進RA滑膜炎性反應，導致關節損傷[23]。

綜上所述，本研究基于辨證為痰瘀痹阻型RA的基礎上進行文獻匯總，分析臨床痰瘀痹阻型RA的用藥規律，并對核心藥物組合川芎-當歸進行網絡藥理學的研究，初步探討可能的作用靶點、通路等。將數據挖掘與網絡藥理學的研究方法結合，為中醫藥治療RA提供參考。但研究結果與實驗研究等仍存在一定差距，應予進一步的研究，為RA提供更精準的治療方向。