巖黃連栓微生物限度檢查方法的適用性試驗

龐云娟, 龐蘭英, 曾 金, 劉康連, 梁曉玲, 龍文洲, 肖 萍

（1.玉林市食品藥品檢驗檢測中心/玉林市中藥材（含香辛料）質量監測與評價工程技術研究中心, 廣西 玉林 537000；2.柳州市婦幼保健院, 廣西 柳州 545001）

巖黃連栓是柳州市婦幼保健院的制劑方, 具有抗炎、鎮痛等作用[1］, 常用于慢性盆腔炎的治療[2］, 為慢性盆腔炎治療提供中醫藥的診療方案。巖黃連栓的主藥成分是巖黃連（Corydalis saxicolaBunting）提取物, 巖黃連為罌粟科紫堇屬植物石生黃堇的全草及肥大的根莖部, 是廣西壯族自治區重要的特色壯藥材之一[3, 4］。巖黃連全草性苦、涼, 其活性成分為巖黃連總生物堿[5］, 具有抗菌、消炎、止痛、抗腫瘤、增強免疫功能等作用[6］。巖黃連栓的輔料組成是混合脂肪酸甘油酯（38 M）[7］（熔點在35～37 ℃）、混合脂肪酸甘油酯（38H）[8］（熔點在37～39 ℃）、羊毛脂[9］（熔點在36～42 ℃）、液體石蠟、吐溫-80。巖黃連栓是不含藥材原粉的半固體直腸給藥制劑, 其微生物限度標準為需氧菌總數103CFU/g、霉菌和酵母菌總數102CFU/g、不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌（1 g）[10］。

本研究結合巖黃連提取物的抑菌作用[11, 12］、輔料熔點影響溶解的問題以及其微生物限度的規定, 按照《中國藥典》2020 年版的要求, 優選出科學、合理、便于操作的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003］、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501］、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003］, 均從廣東環凱微生物科技有限公司購買西林瓶凍干粉菌種, 按照菌種說明書進行復活傳代并制備成甘油凍存管在超低溫冰箱保存（第2代）。

1.2 培養基與試劑

胰酪大豆胨液體培養基（Trypticase soy broth, TSB）、沙氏葡萄糖液體培養基（Sabouraud dextrose broth, SDB）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（Soybean-casecin digest agar, TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（Sabouraud dextrose agar, SDA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（Mannitol salt agar）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基基礎（Cetrimide agar medium base）, 均為北京陸橋技術有限責任公司生產；氯化鈉（分析純）, 丙三醇（分析純）, 均為廣東光華科技股份有限公司生產；吐溫-80（分析純）, 為天津市大茂化學試劑廠生產。

1.3 儀器

LRH-150-M 型霉菌培養箱（廣東省醫療器械廠）, SPX-150F-Ⅱ型生化培養箱（上海龍躍儀器有限公司）, BHC-1300HA2 型生物安全柜（蘇州安春游空氣技術有限公司）, SQ810C 型立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓科技貿易有限公司）, EK-1200i 型電子天平（日本島津公司）, SHZ-88 型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）, 微生物培養箱（德國賓得公司）, HTY-310 型微生物檢驗儀（浙江泰林生物技術股份有限公司）, S25 型圓周振蕩器（德國IKA公司）, Easypet 3 電動助吸器、移液器（德國Eppendorf公司）等。

1.4 試驗樣品

巖黃連栓（批號：20020701、20020702、20020703、20060301、20060302、20060303、200712, 柳州市婦幼保健院）。常溫下為半固體直腸栓劑, 其中批號20020701、20020702、20020703 是2020 年2 月7 日生產, 批號20060301、20060302、20060303 是2020 年6月3 日生產, 批號200712 是2020 年7 月12 日生產。

1.5 方法

1.5.1 菌懸液的制備 按照《中國藥典》2020 年版四部關于菌種的培養制備要求[10］, 并參考菌懸液制備方法進行制備[13］, 從超低溫冰箱取出甘油凍存管菌種解凍至室溫, 分別取200 μL 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的甘油凍存管菌液接種至10 mL TSB 肉湯試管, 33 ℃振搖培養24 h；取200 μL 白色念珠菌的甘油凍存管菌液接種至10 mL SDB 肉湯試管, 23 ℃振搖培養48 h；取1 000 μL 黑曲霉的甘油凍存管菌液接種至200 mL SDA 瓊脂大斜面, 23 ℃培養7 d, 用5 mL 滅菌生理鹽水洗下孢子, 吸出孢子懸液至無菌試管[14］。將上述肉湯試管和黑曲霉孢子菌懸液試管放置2～8 ℃保存, 作為工作用菌液, 試驗前逐級稀釋計數。

1.5.2 供試液的制備 供試品溶液的制備[15, 16］：取樣品10 g, 加至90 mL 稀釋液中, 置45 ℃水浴振搖15 min, 作為1:10 的供試液。用稀釋液依次稀釋成1:20、1:50、1:100、1:200 的供試液, 并置于45 ℃備用。稀釋液和沖洗液：0.9%氯化鈉溶液（即滅菌生理鹽水）, 置于45 ℃保溫備用。

1.5.3 微生物計數法的適用性試驗

1）平皿傾注法預試驗。

①試驗組[17］：取已滅菌的試管, 每管分別分裝10 mL 1:10、1:20、1:50、1:100、1:200 的供試液, 分別加入0.1 mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌懸液（含菌量不超過10 000 CFU/mL）, 充分搖勻, 平行注2 皿, 并澆注相應的培養基。

②菌液組[18］：取已滅菌的試管, 每管分裝10 mL滅菌生理鹽水, 加入0.1 mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌懸液（含菌量不超過10 000 CFU/mL）, 充分搖勻, 平行注2 皿, 并澆注相應的培養基。

③供試品對照組：除不加入菌液, 操作同試驗組。

2）薄膜過濾貼膜法預試驗。

①試驗組[19］：取已滅菌的薄膜過濾器, 每個濾器先加入20 mL 保溫的稀釋液潤濕濾膜[20, 21］, 分別加入1 mL 1:100 供試液, 再分別加入1 mL 金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過100 CFU/mL）, 抽濾, 濾干后, 取膜貼種于提前準備好的瓊脂培養基平板。

②菌液組：取已滅菌的薄膜過濾器, 每個濾器先加入20 mL 保溫的稀釋液潤濕濾膜, 分別加入1 mL稀釋液, 再分別加入1 mL 金黃色葡萄球菌菌懸液（含菌量不超過100 CFU/mL）, 抽濾, 濾干后, 取膜貼種于提前準備好的瓊脂培養基平板。

③供試品對照組：除不加入菌液, 操作同試驗組。

需氧菌總數計數用胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）, 霉菌和酵母菌總數計數用沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）。胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）于33 ℃培養, 其中枯草芽孢桿菌試驗組、薄膜過濾貼膜的銅綠假單胞菌試驗組培養18～24 h, 黑曲霉試驗組培養3 d, 白色念珠菌試驗組培養3～5 d, 其他細菌試驗組培養不超過3 d；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）于23 ℃培養, 其中黑曲霉試驗組培養3 d, 白色念珠菌試驗組培養5 d[22］。

結果判斷：試驗組菌落數減去供試品對照組的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2.0 范圍內[23, 24］。

1.5.4 控制菌檢查方法的適用性試驗

1）金黃色葡萄球菌檢查預試驗。分別取1:10供試液10 mL 分別接種至100、200、500、1 000 mL TSB 培養基中, 加入不大于100 CFU 的金黃色葡萄球菌, 33 ℃培養18～24 h, 劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板, 33 ℃培養18～72 h, 觀察平板的菌落形態[25, 26］。

2）銅綠假單胞菌檢查預試驗。分別取1:10 供試液10 mL 分別接種至100、200 mL TSB 培養基中, 加入不大于100 CFU 的銅綠假單胞菌, 33 ℃培養18～24 h, 劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板, 33 ℃培養18～72 h, 觀察平板的菌落形態[27-29］。

2 結果與分析

2.1 微生物計數法的適用性試驗

2.1.1 需氧菌總數計數方法預試驗結果 平皿傾注法加金黃色葡萄球菌預試驗結果見表1, 薄膜過濾貼膜法加金黃色葡萄球菌預試驗結果見表2。巖黃連栓對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用, 1:200供試品溶液稀釋平皿傾注法、1:100 供試品溶液稀釋薄膜過濾貼膜法能夠消除供試品溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。由于受樣品處方組分的影響, 薄膜過濾貼膜法的沖洗液要維持在40～45 ℃才能確保不堵膜, 需要較長的保溫空間, 采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法, 操作更為簡單方便。

表1 平皿傾注法加金黃色葡萄球菌回收預試驗結果

表2 薄膜過濾貼膜法加金黃色葡萄球菌回收預試驗結果

2.1.2 霉菌和酵母菌總數計數方法試驗結果 平皿傾注法加白色念珠菌預試驗結果見表3。1:10 供試液試驗組中白色念珠菌回收比值在0.5～2.0 范圍內, 表明巖黃連栓對白色念珠菌沒有抑制作用, 采用該方法進行霉菌及酵母菌總數計數是可行的。

表3 平皿傾注法加白色念珠菌回收預試驗結果

2.2 控制菌檢查方法的試驗結果

各試驗組分別在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上劃線分離培養, 結果見表4。巖黃連栓對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用, 采用1 000 mL 增菌液接種法檢查巖黃連栓中的金黃色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接種法檢查巖黃連栓的銅綠假單胞菌是可行的。

表4 控制菌檢查預試驗結果

2.3 微生物計數法適用性試驗驗證結果

取7 個批號的巖黃連栓樣品, 需氧菌總數按1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法、霉菌及酵母菌總數按常規1:10 平皿傾注法進行加菌回收試驗, 結果見表5。結果表明, 采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法對巖黃連栓進行需氧菌總數的測定, 5 種試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內；采用常規1:10平皿傾注法對霉菌及酵母菌總數進行測定, 沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）規定的2 種試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內, 均符合《中國藥典》2020 年版四部1105（非無菌產品微生物：微生物計數法）的規定, 該方法可行。

表5 微生物計數方法驗證試驗的回收比值

2.4 控制菌檢查方法的驗證

取7 個批號的巖黃連栓樣品, 金黃色葡萄球菌按照1 000 mL 增菌液接種法進行加菌驗證試驗、銅綠假單胞菌按照100 mL 增菌液接種法進行加菌驗證試驗, 結果見表6。結果表明, 采用1 000 mL 增菌液接種法對巖黃連栓的金黃色葡萄球菌的測定進行加菌驗證試驗, 采用100 mL 增菌液接種對巖黃連栓的銅綠假單胞菌的測定進行加菌驗證試驗, 符合《中國藥典》2020 年版四部1106（非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法）的有關規定, 該方法可行。

表6 巖黃連栓控制菌檢查方法驗證試驗結果

2.5 巖黃連栓的微生物限度檢查結果

采用1:200 供試品溶液稀釋平皿傾注法進行需氧菌總數測定, 采用常規1:10 平皿傾注法對霉菌及酵母菌總數進行測定, 采用1 000 mL 增菌液接種法檢查金黃色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接種法檢查銅綠假單胞菌, 結果見表7。

表7 巖黃連栓的微生物限度檢查結果

3 小結與討論

本研究建立的巖黃連栓微生物限度檢查方法科學有效、操作方便, 為有抑菌作用且部分處方組分的熔點在35～42 ℃的栓劑提供供試品溶液制備和適用性試驗的方法參考。本研究對7 個批號的巖黃連栓同步進行金黃色葡萄球菌加菌回收預試驗研究, 縮短整個適用性試驗研究的時間, 提高了工作效率。巖黃連栓是醫院制劑, 醫院制劑通常產量較小, 批號之間有時存在一定的差異。對產量較小的制劑, 驗證樣品盡量多一些批號, 能較大程度避免由于批號差異導致的方法不適用的問題, 通過多批次的樣品同步試驗, 提前發現批號差異并反饋給醫院制劑室, 助推醫院制劑工藝穩定發展。