乙醇冷凝回流與超聲波輔助提取葛根藥材總黃酮

曾建光, 徐雨生, 徐 翔, 余正勇, 金晨鐘

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 湖南 婁底 417000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 長沙 410128；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院, 云南 文山 663000）

葛根（Pueraria edulis）又名葛藤、葛麻葉、粉葛藤等, 為豆科植物野葛或甘葛藤蘿的塊根, 其味甘、辛, 性平, 用于外感發(fā)熱頭痛、項背強痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中[1, 2］。葛根是一種藥食同源類植物, 歷來有 “千年人參” 之美稱[3］, 具有很高的食用及藥用價值。藥理學(xué)研究表明, 葛根具有美容養(yǎng)顏、平穩(wěn)血糖血壓、保護(hù)心臟、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[4］。葛根的藥用功能始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》, 《名醫(yī)別錄》記載葛根粉可直接吞服或泡服, 還可以熬湯食用, 可用于治療傷寒、中風(fēng)、頭痛解肌發(fā)表出汗, 開腠理, 療金瘡, 止痛和脅風(fēng)痛叫, 其品質(zhì)直接關(guān)系到公眾藥食的安全性及有效性[5, 6］。

目前, 工業(yè)中藥生產(chǎn)和檢測中常用的傳統(tǒng)提取工藝（索式提取和回流提取等方法）, 具有提取時間長, 影響提出率, 且有的藥材還因加熱時間長, 某些有效成分受到破壞等[7, 8］。為克服傳統(tǒng)方法的不足之處, 尋找對設(shè)備要求簡單、操作簡便的提取方法, 利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù), 努力開發(fā)祖國的植物資源[9］。

本研究通過乙醇冷凝回流和超聲波輔助2 種提取法, 對比分析了3 個不同產(chǎn)地葛根樣品的總黃酮含量, 為后期葛根的規(guī)范化種植及其合理開發(fā)利用提供試驗依據(jù), 為葛根總黃酮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S2s 型恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）；BSA224S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。蘆丁（濃度≥98%, 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司, 生化試劑）；95%的乙醇溶液、無水乙醇溶液（湖北興東城化工有限公司, 分析純）；亞硝酸鈉（NaNO2）（夏縣運力化工有限公司, 分析純）；硝酸鋁[Al（NO3）3］（濟南坤豐化工有限公司, 分析純）；氫氧化鈉（NaOH）（滄州彰化工產(chǎn)品有限公司, 分析純）。

1.2 樣品處理

以產(chǎn)自云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)的野生葛根作為檢測樣本, 樣品編號見表1。樣本沖洗干凈后帶回, 再經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次, 置于預(yù)凍（-40.5 ℃）2 h、低溫（-15 ℃）保持5 h、干燥（35 ℃）16.5 h、升華（15 ℃）8 h 的凍干機凍干。將凍干完全的葛根用粉粹機進(jìn)行粉碎, 過3 號篩后裝入不同編號的廣口瓶中備用。

表1 樣品來源

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品2 mg, 緩慢加入80%乙醇溶液溶解, 定容至50 mL 的具塞容量瓶中, 搖勻, 制備1 mL 含40 μg的對照品溶液。

1.4 波長的選擇

用5 mL 的移液管吸取蘆丁對照品溶液5 mL 轉(zhuǎn)移至25 mL 具塞比色管中, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液加入比色管中, 搖勻, 靜置6 min, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液加入其中, 搖勻, 靜置6 min, 加入4.0 mL 4%的氫氧化鈉溶液, 最后用80%乙醇溶液定容至10 mL, 塞上塞子將其混勻, 靜置15 min。以不加蘆丁對照品溶液的混合液為空白對照, 在波長為200～900 nm 的范圍內(nèi)掃描, 確定了最大吸收波長為476 nm[10］。

1.5 乙醇冷凝回流提取法提取

精密稱取葛根干燥粉3 g 置于經(jīng)過干熱滅菌的具塞錐形瓶中, 用25 mL 的移液管精密加入80%乙醇溶液50 mL, 稱定其樣品錐形瓶溶劑的總重量, 分別用恒溫水浴鍋冷凝回流30、20、10 min, 放冷, 稱重, 補足失重過濾后待用。

取1 mL 濾液到50 mL 具塞容量瓶中, 最后用80%乙醇溶液定容到刻度處, 蓋上塞子搖勻。取5 mL供試品溶液至10 mL 具塞比色管中, 紫外分光光度計依次測定吸光度。

1.6 超聲提取法提取

精密稱取葛根干燥粉3 g 置于具塞錐形瓶中, 用移液管精密加入濃度為80%乙醇溶液50 mL, 稱定其重量, 分別用超聲波清洗器超聲10、20、30 min, 放冷, 稱重, 補足失重過濾后待用。

取1 mL 濾液到50 mL 具塞容量瓶中, 加入80%乙醇溶液到刻度處, 蓋上塞子搖勻。搖勻后精密量取供試品溶液5 mL, 置于10 mL 具塞比色管中[11］, 紫外分光光度計依次測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性試驗結(jié)果

在波長476 nm 處檢測對照品溶液的吸光度, 測定結(jié)果見表2。以對照品吸光度為縱坐標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。蘆丁回歸方程為A=0.352 7C+0.005 4（R2=0.998 9）, 葛根總黃酮對照品濃度在0.4～2.4 μg/mL 符合Beer 定律[12］, 吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 線性試驗結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗 精密量取總黃酮對照品溶液制備顯色液, 重復(fù)測定6 次, 其相對標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表3。從表3 可以看出,RSD為0.02%, 表明試驗精密度良好。

表3 精密度試驗結(jié)果

2.2.2 重復(fù)性試驗 精密稱取3.000 0 g 云南省葛根粉末6 份制備供試品溶液, 并分別在467 nm 波長下測定顯色后的吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量平均值及RSD, 結(jié)果見表4。從表4 可以看出,RSD為0.07%, 表明試驗重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.3 冷凝回流提取法提取不同產(chǎn)地、不同時間葛根總黃酮

分別稱取云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同地方葛根粉各3.000 0 g 置于錐形瓶中, 加入適量乙醇溶解后進(jìn)行冷凝回流, 結(jié)果見表5。并對不同產(chǎn)地樣品總黃酮含量進(jìn)行比較, 結(jié)果見表6、圖2。云南省葛根總黃酮提取最佳時間20 min, 黃酮含量為0.255 7%；廣東省葛根總黃酮提取最佳時間30 min, 黃酮含量為0.210 8%；廣西壯族自治區(qū)葛根提取最佳時間10 min, 總黃酮含量為0.213 2%；不同產(chǎn)地總黃酮含量：云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

圖2 不同產(chǎn)地葛根冷凝回流提取黃酮含量對比

表5 不同產(chǎn)地葛根冷凝回流測定試驗

表6 不同產(chǎn)地、不同時間冷凝提取總黃酮含量

2.4 超聲波輔助提取葛根總黃酮

分別稱取云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同地方葛根粉3.000 0 g 于錐形瓶中, 加入適量乙醇溶解后進(jìn)行超聲波輔助提取（表7）。并對不同產(chǎn)地葛根樣品總黃酮含量進(jìn)行比較, 各樣品的總黃酮含量見表8、圖3。云南省葛根總黃酮提取最佳時間20 min, 黃酮含量為0.171 5%；廣東省葛根總黃酮提取最佳時間30 min, 黃酮含量為0.155 9%；廣西壯族自治區(qū)葛根提取最佳時間30 min, 總黃酮含量為0.204 6%, 不同地區(qū)總黃酮含量：云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

表7 不同產(chǎn)地葛根總黃酮超聲波輔助提取試驗

表8 不同產(chǎn)地、不同時間葛根總黃酮的含量測定

圖3 不同產(chǎn)地葛根超聲波輔助提取黃酮含量對比

3 小結(jié)與討論

近年來, 通過檢測藥材中成分含量來確定被測藥材中成分的數(shù)量, 比較不同儀器提取成分含量評價藥物質(zhì)量[13］。冷凝回流提取法提取工藝是指用有機溶劑提取藥材中的成分[14］, 將葛根藥材粗粉裝入容器中, 加適量的溶劑, 安裝冷凝裝置用恒溫水浴鍋進(jìn)行提取, 回流浸提到規(guī)定的時間, 將回流液進(jìn)行過濾, 得其濾液, 再進(jìn)行相應(yīng)的檢測。與超聲波提取法相比, 冷凝回流提取方法具有受外界溫度、壓力影響小, 不受氣液比的影響, 回收效果穩(wěn)定, 直接回收到有機液體, 無二次污染且、操作方便等優(yōu)點[15］。

通過紫外分光光度法對云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同產(chǎn)地葛根進(jìn)行總黃酮含量測定。云南省總黃酮平均含量為0.257 7%；廣東省葛根總黃酮平均含量為0.210 8%；廣西壯族自治區(qū)總黃酮平均含量為0.213 2%, 葛根總黃酮含量云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

綜上所述, 通過比較超聲波輔助提取和冷凝回流提取葛根總黃酮, 得出較科學(xué)、較簡便的提取方法, 為提取葛根總黃酮的提供參考方法依據(jù)。同時對比分析了云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)3 個不同地方葛根總黃酮含量測定結(jié)果, 為后期葛根的規(guī)范化種植及合理開發(fā)利用提供了依據(jù), 為葛根總黃酮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考價值。