狗蟻草總生物堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原蛋白、細(xì)胞因子的影響

唐云麗, 鄭作文, 甘彩玉, 梁冰潔, 韋建華, 張文濤, 彭 成

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 611137；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 南寧 530200）

據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì), 2017 年全球肝纖維化患者占肝臟疾病患者的60.72%[1, 2］。肝纖維化主要是由肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生所致的[3, 4］, 它不僅會(huì)破壞肝組織結(jié)構(gòu), 還會(huì)影響肝細(xì)胞的血液供應(yīng)。雖然肝纖維化是疾病發(fā)展過程中可逆性的病理進(jìn)程, 但是進(jìn)一步可發(fā)展為肝硬化、肝癌, 嚴(yán)重者造成肝衰竭甚至危及生命[5, 6］。因此, 迫切需要研究出高效的防治方案阻止肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

狗蟻草為廣西壯族自治區(qū)民間常用壯藥之一, 為豆科植物鏈莢豆（Alysicarpus VaginalisL. DC.）的全草, 又名大葉青、山土豆、山花生等, 主要分布在廣西、福建、廣東等地, 在廣西壯族自治區(qū)資源非常豐富[7］。其性涼, 味甘、苦, 具活血通絡(luò)、清熱化濕、接骨消腫、去腐生肌的功效[7］。其單味藥與豬肉燉服可用來治療慢性肝炎[7］。研究發(fā)現(xiàn)狗蟻草乙酸乙酯提取物對(duì)四氯化碳致肝纖維化小鼠有明顯的干預(yù)作用[8］, 證明狗蟻草對(duì)肝纖維化治療有顯著活性成分, 且從狗蟻草乙酸乙酯提取物分離的總生物堿可抑制T6 細(xì)胞的增殖[8-11］, 對(duì)肝星狀細(xì)胞有抑制作用, 但其作用機(jī)制尚未深入研究。已有研究發(fā)現(xiàn)從其他中草藥提取的生物堿可通過降低T6細(xì)胞分泌的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ膠原含量及細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF 含量而抑制T6 細(xì)胞的增殖作用[12］。

本研究以狗蟻草總生物堿（AVTA）為研究對(duì)象, 驗(yàn)證其在體外對(duì)HSC-T6 細(xì)胞藥物活性的基礎(chǔ)上, 研究AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌物Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及促肝纖維化因子PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量的影響, 進(jìn)而探討AVTA 抗肝纖維化作用與細(xì)胞因子之間的關(guān)系, 對(duì)開發(fā)中草藥狗蟻草具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 狗蟻草全草采自廣西壯族自治區(qū)武鳴縣, 經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豆科鏈莢豆（Alysicarpus VaginalisL.DC.）的全草。

1.1.2 試劑 HSC-T6 細(xì)胞株由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS 溶液、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、二甲基亞砜（DMSO）、四氮唑藍(lán)MTT、秋水仙堿（Solarbio 公司）；新生牛血清（Hy-Clone 公司）；Rat ColⅠELISA Kit、Rat Col ⅢELISA Kit、Rat PDGF ELISA Kit、Rat TNF-α ELISA Kit、Rat IGF-1 ELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit（R&D 公司）。

1.1.3 儀器 DLE560 超凈工作臺(tái)（荷蘭Clean Air公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Shel-lab 公司）；DMIRB 倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK 公司）；離心機(jī)（德國(guó)Biofuge Stoctos 公司）。

1.2 方法

1.2.1 AVTA 的提取與鑒定

1）提取。取狗蟻草粗粉用75%乙醇溶液回流提取3 次, 每次回流1.5 h, 過濾, 收集醇提液, 回收乙醇至無醇味稠膏狀。用0.5%硫酸溶液溶解稠膏, 過濾, pH 調(diào)至9～10, 于4 ℃下靜置5 d, 再用等量乙酸乙酯萃取, 收集乙酸乙酯層, 重復(fù)3 次, 回收乙酸乙酯濃縮至稠膏狀, 得膏體, 即得AVTA。

2）鑒定。①沉淀反應(yīng)：取適量膏體, 用0.5%硫酸溶液溶解, 分成3 份, 分別滴加適量的碘化鉍鉀溶液、碘化汞鉀溶液和苦味酸溶液, 觀察現(xiàn)象。②TLC定性：取適量膏體, 用乙酸乙酯溶解, 于硅膠G 板點(diǎn)樣, 展開系統(tǒng)（氯仿:甲醇=3:1）展開, 用碘蒸氣和改良碘化鉍鉀顯色, 觀察現(xiàn)象。

1.2.2 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 0.25%胰酶消化后離心收集, 采用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 在96 孔板中接種, 每孔體積100 μL, 分為9 個(gè)組, 分別為細(xì)胞對(duì)照組和8 個(gè)不同濃度AVTA 組（濃度為52.70、37.65、26.89、19.29、13.72、9.80、7.00、5.00 μg/mL）, 每組5 個(gè)重復(fù)孔[13］。細(xì)胞接種后, 孵育24 h 后棄去原液, 細(xì)胞對(duì)照組加入DMEM 完全培養(yǎng)液, 各給藥組加入相應(yīng)濃度的藥液, 每孔100 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后, 于570 nm 處測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率, 根據(jù)抑制率求出IC50, 根據(jù)抑制率選取3 個(gè)對(duì)細(xì)胞無毒濃度繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。抑制率=（1-給藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100%；IC50由SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。

1.2.3 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量的影響 設(shè)3 個(gè)濃度的AVTA 組（濃度分別為10.00、7.00、4.90 μg/mL）, 并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、秋水仙堿組（終濃度6.25 μg/mL）, 每組5 個(gè)復(fù)孔, 接種后在培養(yǎng)箱中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后, 棄去原培養(yǎng)液, 細(xì)胞對(duì)照組加入DMEM 完全培養(yǎng)液, 各給藥組加入相應(yīng)濃度的藥液, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后, 收集細(xì)胞上清液于3 000 r/min 離心20 min, 取上清液, 按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)COLⅠ、COLⅢ、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)量資料, 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示, 組間比較用t檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)采用t檢驗(yàn)校正公式）, 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞活性影響

如表1所示, AVTA 作用于HSC-T6細(xì)胞48 h后,IC50為44.17 μg/mL, 無毒濃度在13.72 μg/mL以下。

表1 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞無毒濃度測(cè)試（±s, n=5）

表1 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞無毒濃度測(cè)試（±s, n=5）

注：與對(duì)照組比較, “*” 表示差異顯著（P＜0.05）, “**” 表示差異極顯著（P＜0.01）

濃度//μg/mL 0（對(duì)照組）52.70 37.65 26.89 19.29 13.72 9.80 7.00 5.00 OD 值0.89±0.02 0.41±0.15**0.44±0.06**0.64±0.14**0.79±0.09*0.80±0.06 0.82±0.04 0.83±0.06 0.84±0.05抑制率//%54.35 50.30 28.52 11.33 10.50 8.32 6.31 5.56 IC50//μg/mL 44.17

2.2 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的COLⅠ、COLⅢ、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量的影響

由圖1 至圖6 可以看出, 當(dāng)AVTA 終濃度為10.00 μg/mL 時(shí), 與細(xì)胞對(duì)照組相比能顯著抑制HSC-T6 細(xì) 胞 分 泌 的COL Ⅰ、COL Ⅲ膠 原 蛋 白 和PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細(xì)胞因子（P＜0.01 或P＜0.05）, 當(dāng)AVTA 終濃度為7.00 μg/mL 時(shí), 與細(xì)胞對(duì)照組相比, 能顯著抑制HSC-T6 細(xì)胞分泌的COLⅠ、COLⅢ膠原蛋白和TNF-α、IL-6 細(xì)胞因子（P＜0.01 或P＜0.05）。

圖1 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的COLⅠ含量的影響（±s）

圖2 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的COLⅢ含量的影響（±s）

圖3 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的PDGF 含量的影響（±s）

圖4 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的TNF-a 含量的影響（±s）

圖5 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的IGF-1 含量的影響（±s）

圖6 AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的IL-6 含量的影響（±s）

3 小結(jié)與討論

肝纖維化是在炎癥刺激下肝臟細(xì)胞（如HSC等）異常活化而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成過多, 積累沉積而引起[14-21］。治療肝纖維化的關(guān)鍵途徑是抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）活化, 降解其合成的肝內(nèi)膠原如Ⅰ型、Ⅲ型膠原等[22］。為此, 本試驗(yàn)預(yù)先驗(yàn)證了AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響, 明確了AVTA 抗肝纖維化的無毒濃度。已證實(shí)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展與細(xì)胞因子PDGF（血小板衍生生長(zhǎng)因子）、IGF-1、TNF-α、IL-6 等有著密切關(guān)系, 共同作用可促進(jìn)疾病進(jìn)展, 是評(píng)估肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。其中大量分泌的PDGF、IGF 等細(xì)胞因子刺激HSC 異常活化, 異常活化HSC 反過來又能過量分泌PDGF 因子, 進(jìn)而合成分泌TGF-β1、TNF-α 等細(xì)胞因子, 促進(jìn)活化的HSC 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞, 從而使肝竇血流抑制和肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂, 造成肝纖維化病態(tài)[23-25］。

肝星狀細(xì)胞可分泌炎癥因子TNF-α, 可介導(dǎo)NF-кB 信號(hào)傳導(dǎo)通路, 誘發(fā)或加重肝臟炎癥, 加快肝纖維化的發(fā)生, 如昆明山海棠總生物堿就是通過抑制介質(zhì)TNF-α 及NO 的生成來發(fā)揮其抗炎作用[26］。另外, 肝纖維化進(jìn)一步的進(jìn)展可能誘發(fā)肝臟癌變。研究發(fā)現(xiàn), TNF-α 可通過調(diào)節(jié)ROS/HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[27］, IL-6 可通過刺激炎性反應(yīng), 通過影響TIMPs-mRNA、α-SMA、MMPsmRNA 表達(dá), 是ECM 滯留并沉積的關(guān)鍵因素, 而引起ECM 沉積導(dǎo)致肝纖維化的出現(xiàn)受多種細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化過程中的重要事件, 藥物通過阻止PI3K/Akt信號(hào)通路活化而抑制PDGF 誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞活化, 進(jìn)而減少TNF-α、IL-6 的分泌, 提高抗肝纖維化的療效, 如姜黃素可通過多種機(jī)制參與預(yù)防肝纖維化的過程[28］。因此, 通過抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細(xì)胞因子的分泌能有效減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

本研究預(yù)先選取HSC-T6 細(xì)胞進(jìn)行體外藥效試驗(yàn), 證明AVTA對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的無毒濃度[29-30］, 明確AVTA 可能為治療肝纖維化的有效成分, 并進(jìn)一步研究AVTA 抗肝纖維化可能的作用機(jī)制[31］。與細(xì)胞對(duì)照組相比較, AVTA 對(duì)HSC-T6 細(xì)胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細(xì)胞因子有明顯的抑制作用, 也能顯著降低HSC-T6 細(xì)胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6細(xì)胞因子的含量, 且抑制程度呈劑量依賴關(guān)系。AVTA 抗肝纖維化的作用機(jī)制與細(xì)胞因子的表達(dá)有一定相關(guān)性, 具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索研究, 為深入探討狗蟻草治療肝臟疾病奠定了理論基礎(chǔ), 為中草藥狗蟻草的開發(fā)提供科學(xué)意義。