五味子對對氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll樣受體7信號通路相關基因m RNA表達的影響※

梁 可，喬 鐵，李芳瀟，鄭冰元，朱明丹

（遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847）

失眠癥又稱為睡眠障礙（sleep deprivation，SD），是指睡眠的始發和維持發生障礙，致使睡眠質量不能滿足個體生理需要而顯著影響患者白天活動的一種睡眠障礙綜合征[1]。隨著社會的飛速發展，人們的生活節奏不斷加快，工作生活壓力日益增大，越來越多的人患上失眠癥（如入睡困難、早醒、易醒等），長期失眠可造成大腦感覺和智力的敏感度下降，引起社會功能障礙，甚至誘發抑郁及其他精神類疾病[2]。目前，西醫治療失眠癥以苯二氮?類藥物為主，其能通過選擇性地抑制腦干網狀結構的上行激活系統，迅速誘導患者入睡，但因具有成癮性、依賴性等不良反應，臨床療效尚有爭議。

中醫稱失眠癥為“不寐”“不得眠”“不得臥”“目不暝”，認為心主神明，心脾兩虛、心血不足等均可導致失眠。五味子，味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功，可用于治療久嗽虛喘，夢遺，滑精，遺尿，尿頻，久瀉不止，自汗，盜汗，津傷口渴，內熱消渴，心悸，失眠[3]。脾臟是機體重要的免疫器官，可與腦連接共同影響機體的免疫功能[4]。本研究探討五味子對對氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠脾臟Toll樣受體7（TLR7）、干擾素調節因子7（IRF7）、干擾素α（IFN-α）mRNA表達的影響，探討其改善睡眠的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，體質量（250±20）g，雄性，由遼寧長生生物有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

1.2 藥物與試劑 五味子（安徽普仁中藥飲片公司），PCPA（大連美侖生物技術有限公司，批號：MB3073），地西泮片（安定，山東信誼制藥有限公司，批號：170601）；Trizol（美國Invitrogen公司），PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（Takara公司），SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（TliRNaseH Plus公司），ROX plus（Takara公司），水合氯醛、氯仿、異丙醇、75%乙醇均購于國藥集團。

1.3 藥物制備 ①五味子提取物：取五味子適量，10倍量乙醇加熱回流兩次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮，干燥，加生理鹽水溶解，制成0.15 g/m L五味子提取物溶液（其中五味子醇甲含量約為0.43 mg/g）[3，5]。②安定混懸液：將地西泮片研成細末，加水制成0.025 g/m L的安定混懸液。

1.4 主要儀器 熒光定量PCR儀（德國安捷倫公司），蛋白核酸分析儀（美國貝克曼公司），低溫高速離心機（法國Jouan SA公司），Multiskan FC型酶標儀（Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 實驗分組和給藥 SPF級SD雄性大鼠32只，基礎飼料適應性喂養7 d后，隨機分成空白組、模型組、五味子組、安定組，每組8只。模型組、五味子組和安定組按0.3 g/kg體質量確定PCPA混懸液給予劑量，腹腔注射，每日1次，連續4 d。于第5日起，五味子組給予五味子提取物灌胃，安定組給予安定混懸液灌胃，連續14 d。空白組、模型組不予處理。各組大鼠于末次給藥后24 h行水合氯醛麻醉（300 mg/kg），無菌條件下迅速摘取大鼠脾臟組織。

2.2 檢測方法 每個脾組織樣本取中段，約100 mg，加入1 m L Trizol，室溫放置5 m in；4 ℃離心10 m in；取上清液，加入0.2 m L氯仿；震蕩15 s，室溫放置5 min；4 ℃離心15 m in，使溶液分為三相；取上層水相0.4 m L，加入0.5 m L異丙醇；混勻，室溫放置10 m in，使RNA沉淀形成；4 ℃離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇，吹打、洗滌沉淀；4 ℃離心5 m in；棄上清液，空氣干燥至乙醇全部揮發；溶解RNA，取稀釋后的RNA樣品，檢測吸光度，計算RNA濃度。取0.5 μg RNA按10 μL反應體系進行反轉錄，按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明進行操作。使用Primer-BLAST工具設計引物[6]，內參基因為β-actin。TLR7上游引物：5'-GTGCCTTCAAGAAAGATGCCATT-3'，下游引物：5'-TGGTGGAGGAGAACAGAGCTT-3'；IRF7上游引物：5'-TGAACTTAGCCCGGAGCTTG-3'，下游引物：5'-AGGGACATACCCTGTGTGGG-3'；IFN-α上游引物：5'-GTGGTCAAAGCAGAAGTCTGGA-3'，下游引物：5'-TCTTTCTTCTCTCAGTCTTCCCAT-3'。應用熒光定量PCR儀檢測，反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 m in后采集熒光信號，重復40個循環；在循環反應后，按設定條件（95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃30 s）測溶解曲線。在55 ℃升溫至95 ℃過程中，每升高0.5 ℃采集1次熒光信號。

2.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較用方差齊性檢驗，方差分析用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 體征變化結果 造模后，模型組大鼠體質量下降，出現毛少無光、易受驚、煩躁易怒、晝夜節律消失等現象。灌胃后，五味子組與空白組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組大鼠體質量明顯低于空白組（P＜0.01），安定組大鼠體質量低于空白組（P＜0.05）。五味子組與空白組大鼠的身體狀態均相對較好，毛發有光澤，白天安靜倦臥，無煩躁、易怒等癥狀。各組大鼠體質量見圖1。

圖1 各組大鼠體質量比較

3.2 五味子對PCPA致失眠大鼠TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達水平的影響 模型組TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達水平均明顯高于空白組（P＜0.01）；五味子組TLR7、IRF7 mRNA表達水平均明顯低于模型組（P＜0.01）；安定組TLR7、IRF7 mRNA表達水平均明顯低于模型組（P＜0.01），IFN-α mRNA水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠相關基因m RNA表達水平比較（±s）

表1 各組大鼠相關基因m RNA表達水平比較（±s）

注：1.TLR7，Toll樣受體7；IRF7，干擾素調節因子7；IFN-α，干擾素α。2.與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

I F N-α m R N A表達水平組別 只數 T L R 7 m R N A表達水平I R F 7 m R N A表達水平空白組 8 1.0 0±0.0 5** 1.0 0±0.0 7** 1.0 0±0.0 4**模型組 8 2.7 0±0.1 1 4.1 5±0.1 8 1.3 3±0.0 8五味子組 8 1.2 5±0.0 8** 2.6 9±0.1 1** 1.2 7±0.0 8安定組 8 1.5 8±0.1 0** 2.7 0±0.1 5** 1.2 5±0.0 7*

4 討論

免疫系統對睡眠有著重要的調節作用，同時睡眠也直接影響免疫功能，長期睡眠功能紊亂會嚴重影響免疫功能，導致感染、惡性腫瘤、抑郁癥等疾病[8-9]。Toll樣受體是一類信號傳導跨膜受體，在先天免疫和獲得免疫中有重要作用。TLR7主要分布在人體肺、脾臟等組織中，免疫細胞是主要表達TLR7的細胞，鼠類的TLR7與人高度同源[10]。TLR7經過一系列復雜活化過程，介導相關靶基因轉錄，使共刺激分子、促炎因子釋放增加并激活IRF7因子，誘導IFN-α產生[11]。研究表明，TLR7高表達會使疾病發生率明顯升高，而降低則可以緩解疾病[12-13]。IRF7能夠在脾臟、淋巴結和骨髓中表達，可能是一種淋巴細胞特異性因子。激活后的IRF7在炎癥和腫瘤中具有促進和抑制的雙向作用，具體作用可能隨微環境的不同而發生變化[14]。IFN-α能夠使T淋巴細胞進行反向調節，延長活化后的T淋巴細胞生存期，使記憶性T淋巴細胞分化能力增加，還能誘導B淋巴細胞刺激因子，使B淋巴細胞受體與免疫球蛋白結合，最終產生致病的自身抗體[15]。

本研究結果顯示，PCPA所致失眠大鼠體質量下降，出現毛少無光、易受驚、煩躁易怒、晝夜節律消失等現象，TLR7、IRF7、IFN-α mRNA表達水平較高。經過五味子治療后，大鼠體質量與空白組大鼠無明顯統計學差異（P＞0.05），身體狀態相對較好，毛發有光澤，白天安靜倦臥，無煩躁、易怒等癥狀，同時TLR7、IRF7 mRNA表達水平有所降低。五味子可能通過活化TLR7信號通路激活免疫，通過下調TLR7信號通路的相關基因，從而影響免疫因子的釋放，起到改善睡眠作用。本研究僅從基因水平考察五味子改善PCPA致失眠大鼠睡眠情況，后續研究還應從細胞、蛋白等多角度全面分析五味子通過影響免疫而改善睡眠的作用機制。