黃芪甲苷對氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的治療作用及機制

張靜，張秋瓚，王艷榮

天津市第四中心醫院 南開大學附屬第四中心醫院消化內科，天津 300140

目前缺血性心腦血管疾病的發病率及病死率逐漸上升，抗血小板治療是缺血性心腦血管疾病治療的常規及有效措施。但是抗血小板治療是一把雙刃劍，有效預防及治療缺血性疾病的同時，也可引起胃腸道并發癥。黃芪是最常用中藥之一，從黃芪中分離出來的皂苷已有數十種，而甲苷為其主要的活性指標成分。2021 年3 月—2022 年1 月，我們探討黃芪甲苷對氯吡格雷所致胃黏膜損傷大鼠的治療作用及可能的機制，以期為臨床治療及預防抗血小板藥物引起的胃腸道不良反應提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康雄性6 周齡SD 大鼠50 只，體質量180～200 g，中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供及飼養。溫度（24 ± 2）℃，濕度（55 ± 5）%，噪音＜50 db，每12 小時1 次亮暗循環，每籠10只，平衡飼料分籠飼養1周。硫酸氫氯吡格雷（波立維）購自賽諾菲萬安特制藥有限公司；黃芪甲苷購自上海圻明生物科技有限公司；血管內皮細胞生長因子（VEGF）單克隆抗體（兔IgG）、磷酸化血管內皮細胞生長因子受體2（p-VEGFR2）單克隆抗體（兔IgG）一抗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Image Pro Plus 顯微圖像分析與處理系統購自青島美迪康醫療科技有限公司。

1.2 動物分組及干預 將大鼠隨機分為對照組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組，每組10 只，參考大鼠與人折算系數分別予生理鹽水1 mL/100 g、氯吡格雷15.6 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷15 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷30 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷60 mg/kg 灌胃，每日1次，干預1周后脫頸處死大鼠［1］。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 胃黏膜損傷評價 取各組胃壁組織，漂洗干凈后，按文獻［2］標準進行評價。斑點糜爛1 分；糜爛長度＜1 mm 計2 分、1～＜2 mm 計3 分、2～4 mm 計4分、＞4 mm 計5 分。糜爛寬度＞1 mm 時分值×2，各分值相加為損傷指數總分。

1.3.2 胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達檢測 取胃竇部黏膜組織0.2 g，加入9 倍生理鹽水，制成10%胃黏膜組織勻漿，3 500 r/min 常溫離心15 min。剪下大小約1 cm×1 cm 胃竇黏膜組織，于液氮中冷凍保存，然后于-80 ℃冰箱保存備用。采用免疫組化SABC 染色法［3］，用4%多聚甲醛外固定胃黏膜標本，染色、透明和封片。將切片用0.5%甲醇液在室溫下浸泡30 min，蒸餾水洗，熱修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫保存20 min。滴加VEGF、p-VEGFR2 組織一抗（稀釋比例1∶150），4 ℃過夜。PBS 沖冼滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，用PBS 沖洗，滴加SABC，20～37 ℃ 20 min，PBS漂洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片，顯微鏡（×200）下觀察。陰性對照組用PBS 代替一抗。用Image-Pro Plus 分析免疫組化圖片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，進行圖像分析，觀察每個視野下陽性反應的光密度及陽性細胞面積［4］。免疫組織化學結果判定標準：胃黏膜上皮細胞及內皮細胞胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胃黏膜損傷情況比較 50 只大鼠均存活。對照組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組胃 黏膜損傷指數評分分別為0、（10.85 ± 1.43）、（8.76 ± 1.53）、（6.48 ± 1.27）、（3.69 ± 0.87）分。與對照組比較，模型組胃黏膜損傷指數評分高（P＜0.05）；與模型組比較，各黃芪甲苷組胃黏膜損傷指數評分低（P均＜0.05）。黃芪甲苷低、中、高劑量組胃黏膜損傷指數評分比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。

2.2 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達比較 見表1。

表1 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2蛋白表達比較（±s）

表1 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪甲苷低劑量比較，&P＜0.05；與黃芪甲苷中劑量比較，△P＜0.05。

組別對照組模型組黃芪甲苷低劑量黃芪甲苷中劑量黃芪甲苷高劑量n 10 10 10 10 10 VEGF蛋白陽性面積（μm2）2 730 ± 310 1 120 ± 110*1 410 ± 130#2 015 ± 210#&2 540 ± 260#&△光密度0.319 ± 0.018 0.132 ± 0.009*0.160 ± 0.010#0.214 ± 0.010#&0.288 ± 0.014#&△P-VEGFR2蛋白陽性面積（μm2）4 021 ± 420 2 011 ± 201*2 502 ± 203#3 060 ± 245#&3 785 ± 320#&△光密度0.396 ± 0.022 0.164 ± 0.009*0.185 ± 0.102#0.303 ± 0.012#&0.376 ± 0.020#&△

3 討論

目前，口服阿司匹林聯合P2Y12 受體抑制劑的雙抗療法是急性冠脈綜合征及冠脈支架置入術后患者的首選［5］。P2Y12 受體是抗血小板藥物發揮作用的重要靶點。氯吡格雷是目前臨床上應用最廣泛的P2Y12 受體抑制劑之一，它通過腸道吸收后生成能抑制血小板聚集的活性代謝物［6］，起到抗血栓形成的作用。使用氯吡格雷75 mg/d 者與使用阿司匹林100 mg/d 者胃腸道出血風險相當［7-8］。二者合用引起的上消化道出血風險是二者單一用藥的2～4倍［9］。接受抗血小板治療的患者都發生了胃腸道損傷［10］。有研究報道，氯吡格雷可能通過細胞因子、炎癥介質及信號通路等導致胃黏膜損傷［11］。我們前期研究也證實它可以通過影響炎癥細胞因子水平引起胃黏膜損傷。

黃芪甲苷可以通過改變胃黏膜上皮細胞超微結構發揮保護胃黏膜屏障完整性的作用；也可以通過調節炎癥細胞因子及相關信號通路，對損傷胃黏膜起到保護作用［12-13］。李建芝等［14］研究發現，黃芪甲苷可以通過抗氧化、抑制細胞凋亡等機制修復胃黏膜損傷。黃芪甲苷可通過抑制MAPK信號通路激活來抑制胃黏膜炎癥反應，發揮胃黏膜保護作用［15］。本研究發現，氯吡格雷可以引起大鼠胃黏膜損傷，黃芪甲苷可以參與損傷胃黏膜的修復，且隨著劑量增加，修復作用逐漸增強。

VEGF 是一種促血管生成活性的生長因子，具有促有絲分裂、抗內皮細胞抗凋亡、增加血管通透性、促進細胞遷移等作用，可促進新生血管的形成［16］。VEGF 是參與消化性潰瘍愈合的關鍵因子，可通過促進細胞外基質堆積，參與潰瘍的愈合及血管再生［17］。VEGF 受體包括三種，其中VEGFR1、VEGFR2 主要分布于血管。VEGF 可以與VEGFR2特異性結合，VEGFR2在介導內皮細胞增殖、遷移等方面發揮重要功能［18］。研究發現，氯吡格雷通過抑制VEGF-VEGFR2-EPK 信號轉導，抑制胃潰瘍血管形成，從而延遲潰瘍愈合［19］。本研究發現，應用氯吡格雷后大鼠胃黏膜組織中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達下降，而應用黃芪甲苷后大鼠黏膜組織中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達升高。提示氯吡格雷可以通過抑制VEGF、p-VEGFR2 表達對胃黏膜造成損傷，而黃芪甲苷可以促進二者表達，從而減輕氯吡格雷引起的胃黏膜損傷。

綜上所述，黃芪甲苷對氯吡格雷所致胃黏膜損傷具有一定治療作用，其作用機制可能與上調胃黏膜組織VEGF、P-VEGFR2 表達保護胃黏膜屏障有關。