地黃—大蒜輪作對大蒜生長及地黃化感自毒作用的影響

鈕顏宇，郭志祥，徐淑慧，孫香榮，洪利亞，王豐青，張重義，李 娟

(1.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450000；2.福建農林大學作物科學學院，福建福州 350002)

在根類中藥材生產栽培過程中，連作障礙是影響藥材產量和品質的一個非常嚴重的問題。地黃(Rehmanniaglutinosa)是應用廣泛的大宗中藥材之一，其種植過程中連作障礙問題尤為突出，研究發(fā)現(xiàn)連作使地黃葉綠素含量降低，光合能力下降，塊根不膨大[1]。連作地黃根區(qū)有益菌種數(shù)量降低，真菌和放線菌數(shù)量增加[2-3]。目前對地黃連作障礙的研究多集中在分子形成機制方面[4-7]，可應用于實際生產的消減措施的研究較少，參考其他根類藥用植物消減連作障礙的研究發(fā)現(xiàn)，通過運用合理輪作模式可以有效緩解連作障礙，但研究主要側重于輪作對連作障礙作物的影響上，而對選取輪作作物本身的產量和品質鮮少研究。一種合理的輪作模式要在農業(yè)生產系統(tǒng)中推廣，輪作作物的經濟效益也是必須考慮的因素之一。

大蒜(Alliumsativum)具有廣譜殺菌作用，大田生產中常被用來作為前茬作物，研究人員通過鑒定發(fā)現(xiàn)大蒜根系分泌物為鄰苯二甲酸二丁酯、2，6-二異丙基苯酚等酚類物質以及二烯丙基二硫化物[8]，其中二烯丙基二硫化物為大蒜揮發(fā)油中的典型物質。研究表明酚類物質能夠有效防止病蟲害發(fā)生，大蒜根系分泌物主要成分對細菌引起的根腐病、枯萎病有顯著抑制作用[9-12]。在膜側栽培模式下，大蒜與當歸間作，能有效改變土壤微生物數(shù)量，提高土壤酶活性，改善土壤理化性質，緩解當歸連作障礙[13]。前期研究結果也表明，地黃與大蒜間作可以減少連作地黃的死亡率，大蒜或可作為消減地黃連作障礙的倒茬作物[14]。

為了探究地黃—大蒜輪作模式的可行性，本研究對地黃—大蒜輪作模式下，大蒜的生長指標、產量品質以及土壤指標變化進行了分析，并通過根區(qū)土壤化感效應測定及地黃苗盆栽試驗研究輪作大蒜后對地黃化感自毒作用的影響，以期對后期的田間試驗進行結果預估，為建立通過合理輪作模式緩解地黃連作障礙提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試大蒜品種及樣品采集 試驗地位于國家“2011計劃”河南農業(yè)大學原陽基地，大蒜品種選用紫皮大蒜，田間試驗以地黃—大蒜(2020年種植過地黃品種溫85-5的茬地)作為處理組，以玉米—大蒜(前茬為玉米，8年內未種植過地黃的土壤)作為對照組，試驗設3次重復，分別測定土壤基礎氮磷鉀含量，并通過施肥補齊。于2020年10月20日播下蒜種，一壟雙行，壟寬0.4 m。行距 20 cm，株距10 cm。進行常規(guī)田間管理。分別在大蒜幼苗期、生長期、成熟期、收獲期4個時期進行取樣，每個重復按照3點取樣法，各取30株。試驗在2020年10月至2021年5月進行。

1.1.2 土壤樣品采集 地黃收獲期，采集根區(qū)5～20 cm范圍內的土壤，用無菌自封袋裝好后帶回實驗室，碾碎分別過20目、50目篩，除去草根等雜質后陰涼風干，備用。按照以上方法在取樣期分別取對照組與處理組大蒜的根區(qū)土壤。另取地黃根區(qū)土壤(2020年種植地黃的土壤)、地黃大蒜輪作根區(qū)土壤以及空白對照土壤(取8年及以上未種植過地黃的土壤)進行盆栽試驗，碾碎過20目篩除去石子、雜草等雜質，陰涼風干后儲藏備用。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 生長指標 用卷尺測量株高、葉長、葉寬，用游標卡尺測量莖粗。收獲期，全小區(qū)收獲紫皮大蒜，風干表皮后稱質量，折算單產。

1.2.2 生理指標 將收獲期紫皮大蒜用硫酸蒽酮法測可溶性糖含量，考馬斯亮藍染色法測可溶性蛋白含量。

1.2.3 質量指標 按照《中華人民共和國藥典》(2020年版)要求測可溶性浸出物含量，高效液相色譜法(HPLC)測大蒜素含量。色譜條件：色譜柱為AglientZORBAXSB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長214 nm；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；以甲醇與0.2%甲酸水作為流動相進行等度洗脫，柱溫30 ℃。

1.2.4 土壤指標 (1)土壤酶活性。脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法。(2)土壤酚酸。參考李培棟等的方法[15]提取土壤酚酸，稱25 g鮮土于離心管中，加入25 mL 1 mol/L NaOH放置過夜，次日振蕩30 min，離心后過濾離心液用12 mol/L的鹽酸酸化至pH值為2.5，2 h后離心除去胡敏酸，而后將上清液過 0.22 μm 的纖維素薄膜，濾液用HPLC測定(重復3次)。結果按照烘干土質量換算。色譜條件：色譜柱為SunFire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長260 nm；流速1 mL/min；進樣量20 μL；柱溫28 ℃；甲醇(A)-0.2%冰乙酸水(B)系統(tǒng)，梯度洗脫(0～16 min，15%～20%甲醇；16～32 min，20%～32%甲醇)。

1.2.5 根區(qū)土壤中化感物質的提取 取上述重茬土、地黃—大蒜輪作土和對照土各2 000 g，按照土水比為1 g∶2 mL的比例浸泡于燒杯中，攪拌均勻后浸泡過夜，超聲2 h，取上清液過濾，以4 000 r/min離心20 min，40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮濾液至40 mL，即得根區(qū)土壤水提液母液，置于冰箱備用。

1.2.6 根區(qū)土壤化感效應測試 以紗布-濾紙-培養(yǎng)皿法進行種子生物測試，取“1.2.5”節(jié)中制備的根區(qū)土壤水提液母液進行稀釋，均分別設置50.00、25.00、12.50、6.25、0 g/mL(空白組用蒸餾水代替提取液)5個濃度，每個濃度重復3次，每次重復供試60粒地黃種子，試驗前用1%次氯酸鈉水溶液處理地黃種子。分別向培養(yǎng)皿內添加5 mL不同濃度的水提液，置于溫度為28 ℃，光照度為 12 000 lx 左右的人工氣候培養(yǎng)箱內，每天光照 12 h，相對濕度恒定。每天觀察種子發(fā)芽情況，種子生長周期為10 d，自發(fā)芽后每天定時統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，10 d 時測量種子莖長與根長。

1.2.7 地黃苗生長及根系形態(tài)的測定 取上述地黃根區(qū)土壤、地黃輪作大蒜后根區(qū)土壤以及空白對照土壤按照每盆500 g分裝至10 cm×10 cm的方盆，每組處理均重復4次，每個重復5盆，每盆定植4株地黃種子苗(2葉期)，于定植30、60、90 d時統(tǒng)計死亡數(shù)，在90 d時破壞性取樣，用根系掃描儀測定各處理地黃苗根系形態(tài)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS Statistics 21.0數(shù)據(jù)處理軟件對各指標進行分析。

2 結果與分析

2.1 地黃茬口對大蒜生長的影響

2.1.1 地黃茬口對大蒜農藝性狀的影響 由圖1可知，處理組大蒜4個時期的長勢均優(yōu)于對照組大蒜。收獲期時，處理組大蒜的株高、莖粗、葉長，分別比對照組大蒜提高27.14%、18.03%、50.46%，差異均達到極顯著水平。

2.1.2 地黃茬口對大蒜發(fā)育狀態(tài)的影響 由表2可知，處理組大蒜的蒜頭橫徑、縱徑分別高出對照組大蒜6.60%、9.23%，差異顯著，處理組大蒜的蒜頭鮮質量高出對照組大蒜10.45%，處理組間無顯著差異。

表2 地黃茬口對大蒜的發(fā)育狀態(tài)及產量的影響

2.1.3 輪作處理對大蒜品質及生理指標的影響 由表3可知，2組大蒜素的含量均滿足且高出《中華人民共和國藥典》(2020年版)要求，其中對照組大蒜素含量為0.25%，處理組大蒜素含量為0.29%，高出對照組16.00%，差異不顯著。

表3 地黃茬口對大蒜品質及生理指標的影響

2.2 輪作處理對根區(qū)土壤的影響

2.2.1 輪作處理對土壤酶活性的影響 由圖2可知，處理組與對照組土壤蔗糖酶活性在整個生育期呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，與種植前相比分別提升33.90%、7.27%，差異極顯著。處理組與對照組土壤脲酶活性在生育期內均呈先升高后降低趨勢，處理組土壤脲酶活性在幼苗期達到最大值 2.59 mg/(g·h)，高出種植前108.04%，生長期、成熟期與收獲期土壤脲酶活性相對減弱，但與種植前相比仍顯著提升。

2.2.2 輪作處理對土壤酚酸含量的影響 土壤酚酸色譜分析結果見圖3，定量分析結果見表4。由表4可知，與種植前相比，處理組對羥基苯甲酸、香草酸與丁香酸含量均顯著升高；阿魏酸含量極顯著提升，處理組在幼苗期提升475.00%，達到種植前5.75倍水平。香豆酸含量均極顯著降低，含量降低水平最高達到39.20%；對照組對羥基苯甲酸含量在幼苗期達到最高水平 0.14 μg/g，之后逐漸降低，在成熟期、收獲期未檢測到對羥基苯甲酸。與種植前相比，對照組土壤新增了香草酸與丁香酸2種酚酸物質；種植大蒜后在對照組與處理組中均未檢測到咖啡酸。

表4 根區(qū)土壤酚酸含量的變化 μg/g

2.3 輪作前后土壤水提液化感效應研究

2.3.1 根區(qū)土壤水提液對地黃種子萌發(fā)的影響 由圖4可知，添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時，輪作組地黃種子發(fā)芽勢高于組內空白對照以及對照組和處理組。添加濃度為12.50、50.00 g/mL時，發(fā)芽率較空白對照分別提升8.73%、9.53%，差異不顯著。添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時，輪作組地黃種子發(fā)芽率均高于另外2組處理，添加濃度為50.00 g/mL時差異極顯著，差異最大值達68.28%。除組內空白對照，對照組發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨添加濃度增加而逐漸降低；除添加6.25 g/mL濃度外，處理組另3個濃度發(fā)芽勢較組內空白對照降低，處理組組內空白對照發(fā)芽率顯著高于添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時的發(fā)芽率。

2.3.2 根區(qū)土壤水提液對地黃種子生長的影響 由圖5可知，不同濃度下，3組處理莖長均整體呈現(xiàn)隨提取液濃度提升而增加的趨勢；同一濃度下，輪作組地黃莖長小于其他2組。3組處理地黃根長均隨添加濃度的提升呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；添加6.25、12.50、50.00 g/mL濃度時，輪作組根長小于其他2組，且在添加濃度為6.25 g/mL時根長與其他2組差異極顯著，與對照組根長差值最大，可達1.50 cm。化感測試結果表明，輪作后土壤對地黃種子的根長、莖長均有抑制作用。

2.4 輪作處理對地黃苗期生長的影響

2.4.1 輪作處理對地黃苗死亡率的影響 由圖6可知，隨時間增長，地黃苗死亡率為輪作組>重茬組>對照組。生長60 d時，輪作處理后土壤對地黃苗的影響急劇增強，90 d時死亡率為47.5%，比同期地黃根區(qū)土死亡率高出90.00%。

2.4.2 輪作處理對地黃苗地下部分鮮質量的影響 由圖7可知，地黃苗地下部分鮮質量為對照組>輪作組>重茬組，處理間具有顯著性差異；地黃苗期產量為對照組>輪作組>重茬組，對照組產量極顯著高于重茬組與輪作組。

2.4.3 根區(qū)土壤對地黃苗根系形態(tài)的影響 由表5、圖8可知，從投影面積、根表面積和總根體積3個方面分析，均為對照組>輪作組>重茬組，處理組之間有極顯著差異，輪作大蒜處理后根區(qū)土壤對地黃苗期地下部分生長的抑制作用減弱；各處理根系平均直徑之間均無顯著性差異；從根尖數(shù)量分析，輪作組的根尖數(shù)量較大，與對照組相比具有極顯著差異，重茬組的根尖數(shù)量大于對照組，二者之間無顯著性差異。

表5 地黃苗期根系掃描分析結果

3 討論與結論

合理輪作能夠減輕連作障礙，改善土壤環(huán)境，豐富土壤微生物群落，增強土壤相關酶活性，可減輕連作障礙植物復種時的自毒作用[16]。大量資料表明，現(xiàn)代農業(yè)生產提倡采用輪作模式代替單季作物，提高作物產量，穩(wěn)定土壤肥力，提升土地利用率，減少病蟲害[17-19]。研究地黃茬口對大蒜生長發(fā)育以及產量品質的影響，結果表明，處理組大蒜地上部分生長與發(fā)育狀態(tài)較好，產量品質均有一定程度提升，大蒜素含量略高于對照組，其抗菌消炎抗腫瘤的效果更好，臨床療效、經濟效益更高。

土壤酶是土壤中動植物和微生物活動的產物，是數(shù)量極微、作用極大的土壤組成部分，土壤酶的活性可以反映土壤生態(tài)狀況下生物化學過程的相對強度，測定相應酶的活性，可以間接了解該物質在土壤中的轉化情況，作為判斷土壤生物化學過程的強度及評價土壤肥力的指標之一[20]。脲酶是土壤酶中唯一對尿素的轉化有重要影響的酶，尿素只有經過脲酶水解才能被作物吸收[21]。蔗糖酶參與土壤中碳水化合物的轉化，使蔗糖水解為葡萄糖和果糖被植物及微生物利用。蔗糖酶的活性強弱能夠反映土壤熟化程度和肥力水平[22]。本研究結果表明，與種植前相比，處理組與對照組土壤蔗糖酶活性均有一定程度提升，間接活化土壤養(yǎng)分，改善土壤肥力，與前人研究結果[23]相類似。在整個種植過程中，脲酶活性呈下降趨勢，對照組土壤脲酶活性減弱至種植前的53.52%，而輪作處理組土壤脲酶活性雖然較種植前提升了21.76%，但相比幼苗期的脲酶數(shù)據(jù)，仍然是降低的，推測種植初期，大蒜植入對地黃茬地土壤的脲酶活性起促進作用，但在大蒜生長過程中，土壤中的脲酶活性逐漸降低。輪作處理后土壤酶活性顯著升高，預計為后茬地黃帶來較高的土壤肥力，使地黃在連作環(huán)境下，保持相對較高水平的肥料利用率。

近年來，土壤酚酸類物質作為連作障礙產生的主要因素被廣泛研究，前期研究表明，外源添加酚酸類物質引起的地黃化感效應有所差異，添加單體酚酸丁香酸與混合添加香豆酸、丁香酸對地黃生長影響較大，對地黃苗成活率，地黃根系膨大以及根系活力均有顯著抑制作用[24]。本研究結果表明，輪作大蒜處理后，處理組對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸含量均顯著提升，香豆酸含量降低38.69%，咖啡酸損失。對照組香豆酸含量降低25.91%，咖啡酸、對羥基苯甲酸2種酚酸物質損失，新增香草酸、丁香酸2種酚酸物質，阿魏酸含量提升258.62%。地黃茬口輪作大蒜后，根區(qū)土壤酚酸含量以及種類均發(fā)生變化，但總體含量呈上升趨勢。綜合根區(qū)土壤盆栽試驗結果，輪作后能夠提高地黃種子發(fā)芽率，但對幼苗生長具有抑制作用，或受輪作后酚酸尤其是丁香酸含量提升的影響。

本試驗通過田間試驗證明地黃—大蒜輪作提高了大蒜的產量與品質，改善了土壤環(huán)境，土壤酶活性提高，土壤酚酸含量總體上升；通過土壤盆栽試驗表明輪作后土壤對地黃苗期地下部分的抑制作用減弱，但地黃苗死亡率較高，同期進行的地黃—大蒜輪作后復種地黃的大田試驗，也同樣存在地黃出苗率不高的問題。由于受到2021年強降水影響，田間試驗被迫停止。大蒜輪作后對地黃化感自毒的具體影響還有待驗證，其能否作為輪作作物有待商榷。