流式細(xì)胞術(shù)測定馬藍(lán)基因組大小

胡永樂，寧書菊，葉 齊馬小毛蔡國倩魏道智*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300； 3.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

馬藍(lán)Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.為爵床科馬藍(lán)屬多年生草本植物，主產(chǎn)于福建、浙江、四川、貴州等地，其干燥根莖、根稱為“南板藍(lán)根”，莖、葉經(jīng)加工炮制可得青黛，兩者均收錄于2020 年版《中國藥典》［1］。目前，復(fù)方南板藍(lán)根片、復(fù)方感冒靈片、熱毒清片等是市面上常見以南板藍(lán)根為主要原料的中成藥，而青黛也是復(fù)方青黛膠囊、桂林西瓜霜含片、牛黃消炎丸等制劑的重要原料，可見馬藍(lán)開發(fā)利用價(jià)值很高，其中福建馬藍(lán)青黛含量在5%以上，遠(yuǎn)高于2020 年版《國家藥典》 規(guī)定，是福建省大宗道地藥材之一［2］。近年來，野生馬藍(lán)生態(tài)環(huán)境受人類活動破壞嚴(yán)重，種質(zhì)資源保護(hù)和馴化栽培長期未得到重視，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)資源流失，并且栽培種有效成分含量不穩(wěn)定，也使得品質(zhì)參差不齊，故對該道地藥材進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳背景解析具有重要的實(shí)際意義。

馬藍(lán)主要化學(xué)成分為靛藍(lán)、靛玉紅、吲哚酚苷、色胺酮等，在拮抗原微生物、提高機(jī)體免疫功能、保肝等方面功效確切，近年來被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、化妝用品、化工印染、食品加工、農(nóng)業(yè)獸藥等領(lǐng)域［3］，相關(guān)研究也大多集中于成分分析、吲哚類生物堿合成途徑研究［4-5］，但關(guān)于基因組的研究較少，導(dǎo)致其有效成分生物合成通路和調(diào)控機(jī)制研究缺乏系統(tǒng)性，限制了其藥用價(jià)值的深入了解和開發(fā)。基因組大小是生物體單倍體基因組DNA 總量，又稱C值，其數(shù)值測定能為基因組研究提供基礎(chǔ)參考［6］。

流式細(xì)胞術(shù)是融合了激光技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等多學(xué)科知識的自動分析技術(shù)，相較于孚耳根微顯影法、基因組測序法更簡便易行，檢測結(jié)果更穩(wěn)定可靠，是近幾年基因組大小測定的首選方法。因此，本研究采用流式細(xì)胞儀測定馬藍(lán)基因組大小，有助于該植物在生物進(jìn)化、生長發(fā)育、生理生化機(jī)制、代謝機(jī)理方面的深入研究，也可為今后其他植物樣本檢測中內(nèi)參植物和裂解液的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 馬藍(lán)嫩葉采自福建農(nóng)林大學(xué)馬藍(lán)栽培基地，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)魏道智教授鑒定為正品。水稻日本晴作為內(nèi)參，由福建農(nóng)林大學(xué)植物免疫研究中心繁種保存。FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）。MgCl2·6H2O（批號20191114）、檸檬酸鈉（批號20190929）、Na2EDTA（批號20200303）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MOPS（批號0670200911）、PVP-40（批號0507031611）、Triton X-100（批號0694070511）（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司）；β-巰基乙醇（批號WH0221K111，武漢普諾賽生命科技有限公 司）；碘化丙啶（批號550825，美國BD 公司）；RNase A（批號20200318，上海惠凌生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞核懸浮液制備及染色 取馬藍(lán)或日本晴幼嫩葉片約0.1 g，置于0.8 mL 預(yù)冷的mGb 裂解液（含45 mmol／L MgCl2·6H2O、20 mmol／L MOPS、30 mmol／L 檸檬酸鈉、1%PVP-40、0.2% Triton X-100、20 μL／mL β-巰基乙醇、10 mmol／L Na2EDTA，pH 7.5）中，無菌刀片迅速垂直切碎后置于裂解液中，冰上靜置10 min，400 目濾網(wǎng)過濾后得細(xì)胞核懸浮液。在細(xì)胞核懸液中加入一定體積預(yù)冷的1 mg／mL碘化丙啶、1 mg／mL RNase A 溶液，直至兩者終質(zhì)量濃度都為50 μg／mL，冰上避光染色0.5～1 h［7］。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測 將馬藍(lán)與水稻日本晴的核懸浮液等比例混合，采用488 nm 波長藍(lán)光激發(fā)，檢測PI 發(fā)射光熒光強(qiáng)度，每1 次收集10 000 個顆粒，進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，通過Modfit 3.0 軟件分析作圖，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)以保證數(shù)據(jù)可靠性［8］。

1.4 基因組大小計(jì)算 于488 nm 波長處捕捉PI 熒光，其強(qiáng)度可表示基因組DNA 相對含量［9］。分析馬藍(lán)、水稻日本晴PI-DNA 復(fù)合體熒光峰值，通過DNA 含量比值計(jì)算馬藍(lán)基因組大小，公式為基因組大小＝水稻日本晴基因組大小×馬藍(lán)熒光強(qiáng)度／水稻日本晴熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

以前向角散射光（FSC）為橫坐標(biāo)，側(cè)向角散射光（SSC）為縱坐標(biāo)繪制二維密度圖，見圖1A，發(fā)現(xiàn)顆粒大小和密度相同的粒子會聚集在一起，聚集的粒子越多，該區(qū)域的顏色會偏白，以此對馬藍(lán)與水稻日本晴細(xì)胞群進(jìn)行初步分群設(shè)門；兩者峰值無重疊，區(qū)分度良好，表明內(nèi)參較合適。圖1B 可觀察到相對較小的M3，為馬藍(lán)G2期的峰，即DNA 復(fù)制期的峰，這主要是由于該植物比較幼嫩，處于細(xì)胞分裂期的細(xì)胞占有較高比例。水稻日本晴基因組大小為0.42 Gb［10］，以G1期峰計(jì)算DNA 含量，確定馬藍(lán)基因組大小為（0.99±0.01）Gb，見表1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表1 馬藍(lán)基因組大小測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前植物基因組大小數(shù)據(jù)庫（https：／ ／cvalues.science.kew.org／）已在全球范圍內(nèi)收錄植物C 值數(shù)據(jù)一萬多種。C 值與細(xì)胞大小、體積、質(zhì)量、發(fā)育速率等細(xì)胞水平上的表型特征存在正相關(guān)，是具有物種特性的常數(shù)。近年來，利用流式細(xì)胞術(shù)測定基因組大小的研究已在大量植物中開展。王珧等［11］通過流式細(xì)胞儀測定甘薯近緣野生種Ipomoea cordatotriloba 的基因組大小為（539.69±13.76）Mb，與二代Illumina 測序平臺經(jīng)K-mer 分析得到的560.70 Mb 相比誤差較小。張小燕等［12］通過流式細(xì)胞術(shù)檢測人參基因組大小約為3.42 Gb，K-mer 分析預(yù)估為3.35 Gb；段先飛等［13］也對廣金錢草基因組大小進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和Genome Survey 測定，結(jié)果表明2 種方法估算數(shù)值基本一致。采用流式細(xì)胞術(shù)測定C 值時(shí)需要注意裂解液和內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)的選擇，裂解液要能使細(xì)胞核充分解離，同時(shí)盡量避免產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片，本研究選用的mGb 裂解液可使細(xì)胞核解離較完全，水稻和馬藍(lán)變異系數(shù)分別為3.81%、3.53%，均小于5%，表明所檢測的細(xì)胞核顆粒較均勻，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)植物的C 值要與待測樣品相近，且遺傳穩(wěn)定、精確性高，細(xì)胞核易提取。本研究曾嘗試使用模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana為內(nèi)參，但擬南芥基因組大小為125 Mb，馬藍(lán)約為其8 倍，差距較大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)過篩選，最終確定水稻日本晴為內(nèi)參，該植物全基因組測序已完成，基因組大小合適，遺傳背景清晰穩(wěn)定，是常用且可靠的參照對象。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測得直方圖可見馬藍(lán)樣品和參照物峰值無重疊且區(qū)分度良好，符合要求，通過熒光強(qiáng)度對照算得馬藍(lán)基因組大小約為（0.99±0.01）Gb。馬藍(lán)、菘藍(lán)和蓼藍(lán)等都是中藥青黛的源植物，主要藥效成分為靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮等生物堿類化合物。盡管主要成分、藥理作用有相似之處，但幾種藍(lán)靛植物隸屬于不同科、屬，指紋圖譜以及組織形態(tài)差異較大。對馬藍(lán)基因組進(jìn)行解析，將有助于揭示其遺傳藍(lán)圖，開發(fā)培育優(yōu)良品種。現(xiàn)階段藍(lán)靛植物中菘藍(lán)的分子生物學(xué)研究較多，已通過測序組裝，構(gòu)建了大小為293.88 Mb 的參考基因組，注釋了30 323 個蛋白編碼基因，并獲得了一些參與吲哚類、萜類和苯丙酸類代謝途徑的候選基因［14］。此外，昆明植物所結(jié)合MinION 單分子和Hi-C 測序技術(shù)組裝獲得了板藍(lán)Strobilanthes cusia基因組865 Mb［15］。馬藍(lán)為福建省重要道地藥材，遺傳進(jìn)化和生態(tài)環(huán)境的獨(dú)特性是其質(zhì)優(yōu)效佳的根本原因，基因組測序?qū)⒂兄诮馕龅赖厮幉倪z傳與環(huán)境的交互作用，從分子水平深入了解有效成分合成機(jī)制。課題組現(xiàn)階段已完成了福建馬藍(lán)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄組測定，并對吲哚類生物堿代謝通路的5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶、色氨酸合成酶等關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了克隆分析［4，16-17］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測定馬藍(lán)基因組大小，將為后續(xù)馬藍(lán)基因組高通量測序組裝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為流式細(xì)胞技術(shù)在藥用植物基因組大小測定領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。