基于UPLC-MS 法及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)紫紅參質(zhì)量標(biāo)志物

林 源，朱雪艷，黃豆豆，黃寶康，王宏瑞，卜其濤*，張成中*

（1.溫嶺市中醫(yī)院，浙江 溫嶺 317500； 2.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 200433； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

人參Panax ginsengC.A.Meyer 是傳統(tǒng)的名貴補(bǔ)益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其炮制方法及炮制工藝眾多，形成生曬參、紅參、糖參等。紫紅參又稱黑參，其制備工藝主要有生物發(fā)酵法和多次蒸曬法［1-2］，在加工炮制過程中，其有效成分人參皂苷等發(fā)生水解、脫羧、異構(gòu)化等［3］變化。經(jīng)測(cè)定，生人參中含量較高的人參皂苷Rb1、Rg1、Re 等在紫紅參中無法檢出或含量降低［4］，稀有皂苷如人參皂苷Rg3、Rg5、Rg6 等含量升高［5-7］。研究發(fā)現(xiàn)，紫紅參相比生曬參、紅參具有更好的降血糖［8］、降血脂［9］、減肥［10］、抗癌［11］、保肝［12］、抗病毒［13］等作用。中藥炮制“生熟異用”，紫紅參與生曬參、紅參在化學(xué)成分及藥理作用上具有差異，其質(zhì)量控制、藥理作用也應(yīng)有別于紅參等。目前，紫紅參的炮制工藝尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量控制、活性成分、藥理作用等方面尚有較大的研究空間［14］。劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的新概念［15］，中藥Qmarker 從生源途徑、化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、炮制加工過程、藥效研究、中醫(yī)理論等層面，將中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、有效性、質(zhì)量控制密切關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q／TOF-MS 法測(cè)定紫紅參及其原料藥人參之間的化合物差異，通過多元統(tǒng)計(jì)分析解析炮制對(duì)人參皂苷種類的影響，鑒定紫紅參中差異性稀有皂苷，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［16］與分子對(duì)接［17］技術(shù)對(duì)所鑒定的差異化合物進(jìn)行驗(yàn)證，研究紫紅參差異化合物的藥理活性及其作用機(jī)制，預(yù)測(cè)紫紅參潛在Q-marker，以期為紫紅參后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 1290 UPLC 型液相色譜儀串聯(lián)6530 Q／TOF 型高分辨質(zhì)譜（美國安捷倫公司）；SK7200H 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；RH-600A 型高速多功能粉碎機(jī)（江蘇榮潔醫(yī)療科技有限公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Centrifuge5810R 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；電蒸鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；鼓風(fēng)式干燥箱（上海般諾生物科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 人參購于亳州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室黃寶康教授鑒定為正品。乙腈、甲醇為色譜純，購自德國Merck 公司；甲酸為色譜純，購自美國Thermo Fisher 公司；水為蒸餾水，購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法

2.1 紫紅參炮制前后成分差異分析

2.1.1 UPLC-MS 條件

2.1.1.1 色譜 Acquity UPLCBEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～23% B；5～9 min，23%～30% B；9～13 min，30% B；13～13.55 min，30%～35%B；13.5～17 min，35%B；17～17.5 min，35%～39%B；17.5～20 min，39% B；20～26 min，39%～95% B）；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓4 000 V（正離子模式）、3 500 V（負(fù)離子模式）；錐孔電壓65 V；脫溶劑氣體氮?dú)猓粴怏w體積流量11 L／min；脫溶劑溫度350 ℃；離子源溫度150 ℃；掃描范圍m／z100～1 700；掃描時(shí)間3.00 spectra／s；碰撞能量30 eV；碰撞氣體氮?dú)猓粧呙璺绞絘llionfragment 模式。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件Masshunter 工作站。

2.1.2 供試品制備 取人參6 批，各分成2 份，1 份凈制，另1 份經(jīng)九蒸九曬制成紫紅參。各取人參、紫紅參粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取粉末50 mg，置于5 mL EP 管中，加入2 mL 80%甲醇，常溫下超聲處理（50 kHz，760 W）30 min，放冷，14 000 r／min 離心15 min，取上清液，即得。

2.1.3 多元統(tǒng)計(jì)分析 查閱并整理歸納國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于人參化學(xué)成分的信息，包括名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式，并將所有信息導(dǎo)入Masshunter 軟件中，創(chuàng)建人參專屬數(shù)據(jù)庫。將allionfragment 模式下采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Masshunter軟件中，用所建立的分析方法對(duì)人參化學(xué)成分進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，得到初步的化合物鑒定結(jié)果，進(jìn)一步運(yùn)用Masshunter軟件對(duì)正離子與負(fù)離子模式下的總離子流（TIC）進(jìn)行處理，結(jié)合目標(biāo)化合物特征離子的精確質(zhì)量數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間、分子式、對(duì)照品信息以及相關(guān)報(bào)道的文獻(xiàn)，進(jìn)行人工識(shí)別并確定。

將采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化（RAW 格式轉(zhuǎn)化成ABF 格式），MS-DIAL 軟件可以基于轉(zhuǎn)化后的ABF 格式進(jìn)行數(shù)據(jù)的預(yù)處理，參數(shù)設(shè)置為保留時(shí)間0.5～25 min；掃描范圍m／z100～1 700；MS1 質(zhì)量誤差0.01 Da；MS2 質(zhì)量誤差0.02 Da；最低峰高5 000。采用SIMCA-p14.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析。將MS-DIAL 軟件處理后得到的歸一化數(shù)據(jù)，以Excel 格式導(dǎo)入SIMCA-p14.1 軟件中，依次進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）；根據(jù)兩組之間t檢驗(yàn)得出的P值（P＜0.05）進(jìn)行差異化合物篩選。

2.2 質(zhì)量標(biāo)志物作用靶標(biāo)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè) 根據(jù)UPLCMS 分析結(jié)果選擇紫紅參中特有而人參中不具有的化合物，再通過PubChem 數(shù)據(jù)庫查詢相關(guān)化合物Canonical SMILES編號(hào)，輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）獲取化合物所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的Uniprot ID。再將其導(dǎo)入在線STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫軟件（https：／ ／string-db.org／cgi／input.pl）進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。利用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／metascape.org／gp／index.html）對(duì)潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。最后通過Cytoscape 3.8.2軟件，篩選核心靶標(biāo)，并構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路” 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系綜合分析結(jié)果。

2.3 差異成分-靶標(biāo)分子對(duì)接 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫選取人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3、Rk1、compound K 等成分化合物結(jié)構(gòu)，選取“成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)中自由度前3 的靶標(biāo)為對(duì)接靶標(biāo)，檢索PDB 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／）獲得靶標(biāo)的蛋白結(jié)構(gòu)，將上述蛋白與化合物結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入pymol 軟件進(jìn)行去水、加氫、刪除重復(fù)鏈等預(yù)處理，最后模擬靶標(biāo)和作用的化學(xué)成分結(jié)合模式，計(jì)算結(jié)合能，結(jié)合能小于0 表明可以自由結(jié)合［17］。

3 結(jié)果

3.1 基于UPLC-MS 的紫紅參特有成分分析

3.1.1 多元統(tǒng)計(jì)分析炮制對(duì)成分的影響 取“2.1.2” 項(xiàng)下人參及其炮制品紫紅參供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到正、負(fù)離子模式下人參及其炮制品紫紅參代表性樣品總離子流圖（圖1）。結(jié)果顯示，紫紅參相對(duì)于其原藥材人參，成分變化較明顯，在長時(shí)間段出現(xiàn)新的化合物峰。進(jìn)一步比較人參生品與紫紅參炮制品之間的區(qū)別，通過無監(jiān)督PCA 分析和有監(jiān)督PLS-DA 分析，得分散點(diǎn)圖見圖2，結(jié)果顯示，生品、炮制品能得到較好的分離趨勢(shì)，說明人參經(jīng)九蒸九曬制成紫紅參后其化學(xué)成分發(fā)生顯著變化。

圖1 人參、紫紅參UPLC-MS 檢測(cè)總離子流圖（TIC）

圖2 炮制前后人參藥材的PCA 得分圖

3.1.2 紫紅參差異化合物鑒定 共鑒定10 個(gè)差異性化合物，包括稀有皂苷人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、compound K、人參皂苷Rh3 等，見表1。

表1 紫紅參差異性化合物鑒定

3.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的紫紅參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物預(yù)測(cè)

3.2.1 紫紅參潛在質(zhì)量標(biāo)志物作用靶標(biāo)篩選 根據(jù)

“3.1.2” 項(xiàng)下化合物鑒定結(jié)果，結(jié)合紫紅參中英文文獻(xiàn)研究，選擇紫紅參中含有而其原料藥人參中所不具有或含量甚微的化合物人參皂苷Ra1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、姜狀三七苷R1、compound K、人參皂苷Rh3、人參皂苷Rs5［7］等，獲取其所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的Uniprot ID，去除重復(fù)，共得到158 個(gè)潛在靶點(diǎn)。“紫紅參-成分-潛在靶點(diǎn)” 可視化網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，網(wǎng)絡(luò)中包括167個(gè)節(jié)點(diǎn)和262 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值3.138。節(jié)點(diǎn)的度值代表與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)的度值越大，該節(jié)點(diǎn)在圖中的大小也就越大，顏色也越深。

圖3 基于潛在質(zhì)量標(biāo)志物構(gòu)建的“紫紅參-成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.2 化合物蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將8 個(gè)化合物篩選出的158 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評(píng)分值為“high confidence＞0.9”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)設(shè)置不變，獲得化合物靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），共獲得91 個(gè)節(jié)點(diǎn)，347條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為7.63，預(yù)期邊數(shù)117，PPI 富集P值＜1.0×10－16。再對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯?jì)算選取間隔度、親密度、自由度值3 個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)，共篩選24 個(gè)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)大于均值（218.8、0.003、7.93）的核心靶標(biāo)（圖5），包括原癌基因（JUN）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子R（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、絲裂原活化蛋白激酶1、3、8（MAPK1、MAPK3、MAPK8）等。

圖5 核心靶點(diǎn)篩選

3.2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析 根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05，共篩選出2 973 條GO 本體條目，其中靶點(diǎn)經(jīng)生物過程相關(guān)條目2 464 條，主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)等；細(xì)胞組分有233 個(gè)條目，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、細(xì)胞-基底連接等；分子功能有276 個(gè)條目，主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性等，各選取顯著性前10 條目展示，見圖6。KEGG 通路富集分析得到247 個(gè)條目，結(jié)果僅顯示顯著性前20 的條目，主要涉及癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、癌癥中的PD-L1 表達(dá)和PD-1 檢查點(diǎn)通路、催乳素信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、胰腺癌、乳腺癌、乙肝等，見圖7。

圖6 GO 富集分析

圖7 KEGG 富集分析

3.2.4 構(gòu)建“紫紅參-成分-靶標(biāo)-通路” 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)篩選所得紫紅參中8 個(gè)潛在質(zhì)量標(biāo)志物作用與疾病相關(guān)的24個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)及20 個(gè)關(guān)鍵通路見表2，“紫紅參-成分-靶標(biāo)-通路” 的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖見圖8，其中包括53 個(gè)節(jié)點(diǎn)和472 邊，平均節(jié)點(diǎn)度值17.8。節(jié)點(diǎn)的度值代表與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)的度值值越大，該節(jié)點(diǎn)在圖中的大小也就越大，顏色也越深。由圖 8 可知，STAT3、Akt1、MAPK1、MAPK3、EGFR、HRAS、PIK3CA 等靶點(diǎn)的連接度較高，可能是紫紅參發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、癌癥中的PD-L1 表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、催乳素信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路等20 條信號(hào)通路可能是紫紅參發(fā)揮藥理活性的關(guān)鍵信號(hào)通路。

圖8 “紫紅參-成分-核心靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖

表2 紫紅參網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)關(guān)鍵信號(hào)通路

3.3 成分-靶標(biāo)的分子對(duì)接 選擇度值排名前3 的核心靶點(diǎn)（STAT3、PTAFR、FGF1）與主要差異性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，以厄達(dá)替尼Erdafitinib 為陽性對(duì)照藥，選取最低結(jié)合能組合，見表3。結(jié)果表明，人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3 等與3個(gè)靶蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，見圖9，其中結(jié)合能越小，則結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)，對(duì)接的活性越好。

圖9 差異成分-關(guān)鍵靶標(biāo)分子對(duì)接可視化

表3 成分-靶標(biāo)分子對(duì)接結(jié)果

4 討論與結(jié)論

經(jīng)UPLC-Q／TOF-MS 檢測(cè)及多元統(tǒng)計(jì)分析解析發(fā)現(xiàn)，紫紅參中人參皂苷Ra1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、姜狀三七苷R1、compound K、人參皂苷Rh3 等為其原料藥人參中所不具有或含量甚微的稀有皂苷類成分。人參經(jīng)反復(fù)蒸曬，人參皂苷發(fā)生水解、脫羧、異構(gòu)化等復(fù)雜的化學(xué)變化后，轉(zhuǎn)化或產(chǎn)生新的人參皂苷，如Rg3、Rg5、Rs4、Rs5、Rh2、Rh3、Rk1、Rk3、CK、F1 等［7，18］，其中人參皂苷Rg3［19］、Rg5［20］、Rk1［21］、Rh2［22］、Rh3［23］、CK［24］等具有顯著藥理活性。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)紫紅參潛在的Q-Marker，將中藥Q-Marker 的研究思路與紫紅參的炮制相結(jié)合，闡明炮制過程中化學(xué)成分的變化及其對(duì)炮制前后藥理活性差異的影響，揭示紫紅參炮制對(duì)Q-Marker 的影響，探尋紫紅參潛在的Q-Marker［25］。

本實(shí)驗(yàn)在UPLC-MS 鑒定的基礎(chǔ)上選擇差異性化合物人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3 等，分別構(gòu)建“紫紅參-成分-靶點(diǎn)”及“紫紅參-成分-核心靶點(diǎn)-通路” 關(guān)系網(wǎng)，經(jīng)GO、KFGG富集分析，發(fā)現(xiàn)紫紅參可通過調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)，包括STAT1、VEGF、EGFR、MAPK1、磷脂酰肌醇-3-激酶亞基（PIK3CA）、蛋白激酶（Akt1）、雷帕霉素機(jī)械靶蛋白（MTOR）等24 個(gè)核心靶點(diǎn)，作用于癌癥通路、內(nèi)分泌抵抗糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路等。

有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3 可能通過抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路，調(diào)控其下游相關(guān)增殖和凋亡蛋白的表達(dá)，抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［26］。人參皂苷Rh2 可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR 而阻止受體磷酸化，從而抑制PI3KAkt-mTOR 信號(hào)通路，并最終抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長［27］。人參皂苷Rg5 可通過抑制Akt 信號(hào)通路的活化，抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用［28-29］。同樣，人參皂苷Rk1 能夠通過抑制ROSPI3K-Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡［30］；人參皂苷CK的抗癌及降糖作用也與PI3K-Akt 信號(hào)通路有關(guān)［24］。本研究表明，紫紅參中差異性人參皂苷Rg3、Rg5、Rk1、Ck 等對(duì)Akt、EGFR、PI3K、mTOR、STAT 等蛋白產(chǎn)生作用，通過PI3K-Akt-mTOR 信號(hào)通路、癌癥通路等表現(xiàn)出抗乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等藥理活性，與本實(shí)驗(yàn)中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的預(yù)測(cè)相符合，人參皂苷Rg3、Rg5 等具有紫紅參潛在質(zhì)量標(biāo)志物的特性。

本研究所篩選差異性化合物可以作為紫紅參潛在的QMarker，可為紫紅參后續(xù)藥理作用及質(zhì)量控制研究提供基礎(chǔ)，有助于提高人參炮制產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。