益神顆粒對環磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能及腸道菌群的影響

張艷艷孫麗麗潘綿立王松坡沈龍海*

（1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437；2.上海市生物物質成藥性評價專業技術服務中心，上海 200437； 3.上海交通大學附屬第一人民醫院，上海 200437）

益神顆粒是國醫大師、滬上張氏內科第12 代傳人張鏡人教授的經驗方，為上海市第一人民醫院院內制劑，用于腫瘤切除術后的輔助治療。該方中靈芝具有補虛安神之功，用于一切虛勞諸疾；黃精補脾潤肺，用于脾肺不足所致納差、氣短、體倦乏力等，二者相合，靈芝益神而養精氣、黃精補中而安五臟，共為君藥。黃芪補氣升陽、固表內托，為臣藥。當歸養血補血、補中有行。何首烏，補肝腎益精血。以上5 味相伍，可先后天同調，氣血共補，有良好的扶正之效。

現代藥理學研究證明，靈芝、黃精和黃芪等均可通過影響固有免疫、特異性免疫或腸道菌群等來調節免疫系統［1-4］。本研究擬通過建立環磷酰胺（CTX）誘導小鼠免疫異常模型，探究益神顆粒對小鼠免疫功能和腸道菌群等方面的調節作用。

1 材料

1.1 實驗動物 32 只SPF 級雄性BALB／c 小鼠，體質量（20±2）g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0006，動物實驗經倫理審查通過（編號2021f097），飼養于上海藥理評價中心動物房內，溫度（25±1）℃，相對濕度50%～70%，12 h／12 h 交替照明，給予顆粒飼料，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 環磷酰胺（CTX，美國百特國際有限公司，批號9J339A）；益神顆粒（由上海市第一人民醫院中醫科提供，批號20210401）。CCK-8、胰蛋白酶、紅細胞裂解液（武漢谷歌生物科技有限公司，批號FZ193503、HP203411、HJ202408）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號205946RP）；1640 培養液（以色列Biological Industries公司，批號2051244）；刀豆蛋白A（美國Simga 公司，批號P1659069）；小鼠淋巴細胞分離液（上海達科為生物技術有限公司，批號RLS2101）；FITC-CD3、APC-CD4、PECD8、PC5.5-CD4、APC-IFN-γ 抗體、Cyto-FastTMFix／Perm Buffer Set（美國Biolegend 公司，批號B303301、B295393、B311090、B318293、B335090、B335927）。

1.3 儀器 電子天平（德國賽多利斯公司，型號ALC-210.3）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，型號SWCJ-2FD）；二氧化碳培養箱、冷凍離心機、全波長多功能酶標儀（美國Thermo 公司，型號371、Micro2R、Varioskan Flash）；低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號TDZ5-WS）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司，型號CytoFLEX）；細胞計數儀（美國DeNovix 公司，型號Celldrop I）。

2 方法

2.1 造模及給藥 小鼠適應性飼養5 d，按體質量隨機分為正常組、模型組和益神顆粒低、高劑量組，每組8 只，益神顆粒低、高劑量組灌胃給予2.5、5.0 g／kg 益神顆粒，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續15 d，于給藥后第8～10 天，模型組和益神顆粒組小鼠腹腔注射80 mg／kg CTX進行造模，實驗結束后對各項指標進行檢測。

2.2 體質量和臟器指數檢測 給藥期間，各組小鼠每3 d測定1 次體質量，繪制體質量變化曲線。給藥結束后，斷頸處死各組小鼠，分離脾臟和胸腺并稱定質量，計算臟器指數。

2.3 外周血白細胞和骨髓有核細胞計數 給藥結束后，各組小鼠眼眶取血，肝素鈉抗凝，利用全自動血液分析儀進行外周血白細胞（WBC）計數。同時，各組小鼠取右側股骨，用10 mL 3%醋酸液沖洗骨髓內細胞，制成細胞懸液，細胞計數儀計數骨髓有核細胞（BMNC）。

2.4 脾淋巴細胞增殖檢測 無菌條件下取出小鼠脾臟，置于生理鹽水培養皿中，剪碎后過200 目尼龍篩網，收集脾細胞懸液，1 000 r／min 離心，棄上清獲得細胞沉淀，按照1∶5 的比例加入紅細胞裂解液，吹打均勻，冰上靜置5 min，1 000 r／min 離心后棄上清，用含10% 胎牛血清的1640 培養基重懸細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 h，收集懸浮細胞，離心后重懸制備密度為5×106／mL 的淋巴細胞懸液，取200 μL 淋巴細胞懸液，加入1 μL 刀豆蛋白A（ConA，終質量濃度為5 μg／mL），混合后加入到96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，培養結束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，2 h 后用酶標儀于450 nm 波長處測定光密度（OD）值，以OD值表示增殖能力。

2.5 流式細胞儀檢測脾臟T 淋巴細胞亞群

2.5.1 CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T 細胞亞群檢測 將“2.4”項下制備的脾淋巴細胞制成密度為1×107／mL 的細胞懸液，取100 μL 單細胞懸液，分別加入CD3、CD4、CD8a 抗體，混勻后于冰上避光孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，100 μL Cell Staining Buffer 重懸后上機檢測。另設4 個對照組，分別為空白對照（不加抗體）、CD3對照（只加CD3 抗體）、CD4 對照（只加CD4 抗體）、CD8對照（只加CD8a 抗體），其余操作步驟同上。

2.5.2 Th1 細胞亞群檢測 將“2.4” 項下制備的脾淋巴細胞制成密度為1×106／mL 的細胞懸液，加入適量的Cell Activation Cocktail（含Brefeldin A）刺激6 h，收集細胞懸液，離心，重懸后調整細胞密度為1×107／mL，取100 μL單細胞懸液，加入CD4 抗體，混勻后于冰上避光孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，加入150 μL Cyto-FastTMFix／Perm Buffer，混勻后室溫孵育20 min，1 mL Cyto-FastTMPerm Wash solution 洗滌2 次，加入IFN-γ 抗體，混勻后室溫孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，200 μL Cell Staining Buffer 重懸，上機檢測。另設3個對照組，分別為空白對照（不加抗體）、CD4 對照組（只加CD4 抗體）和IFN-γ 對照組（只加IFN-γ），其余操作步驟同上。

2.6 外周血T 淋巴細胞亞群檢測 眼眶采血獲得小鼠新鮮外周血，肝素鈉抗凝，用無菌PBS 稀釋1 倍，向15 mL 離心管中加入3 mL 小鼠淋巴細胞分離液，將稀釋后的血液平鋪在淋巴細胞分離液上層（緩慢加入，避免破壞兩液體的分界面），800×g離心20 min，取白膜層即得外周血淋巴細胞，重懸計數，調整細胞密度為1×107／mL，后續步驟同“2.5.1” 項。

2.7 腸道菌群多樣性分析 給藥結束后，每組各選取5 只小鼠取新鮮糞便，樣品置于無菌EP 管中，－80 ℃保存。所有樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序工作，隨后在美吉生物在線云平臺上進行數據處理與分析，比對數據庫為Silva（Release138 http：／ ／www.arb-silva.de），α多樣性指數組間差異檢驗采用Wilcoxon rank-sum test，物種差異分析采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。

2.8 統計學分析 數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 益神顆粒對免疫抑制小鼠體質量和臟器指數的影響如圖1 所示，給藥期間，正常組小鼠體質量保持穩定增長，活動度良好；模型組小鼠注射CTX 后體質量下降，毛色暗淡，活動度降低；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠體質量下降減緩，說明益神顆粒能夠恢復小鼠體質量，改善小鼠活動度，提高生存質量。如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟和胸腺指數降低（P＜0.01），說明模型復制成功；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠的脾臟指數升高（P＜0.01），說明益神顆粒對CTX 造成的臟器損傷有改善作用。

圖2 各組小鼠臟器指數變化（±s， n＝8）

3.2 益神顆粒對免疫抑制小鼠WBC 和BMNC 計數的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組小鼠WBC 和BMNC 數量減少（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠WBC 和BMNC 數量增加（P＜0.01），說明益神顆粒能夠減輕CTX 對骨髓的破壞，增加WBC 和BMNC 數量。

表1 各組小鼠WBC 和BMNC 計數比較（±s， n＝8）

表1 各組小鼠WBC 和BMNC 計數比較（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 益神顆粒對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組小鼠脾淋巴細胞增殖能力降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力增加（P＜0.05），說明益神顆粒可提高淋巴細胞增殖能力。

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力比較（±s， n＝8）

表2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力比較（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 益神顆粒對免疫抑制小鼠脾臟T 淋巴細胞亞群的影響 如圖3A 所示，與正常組比較，模型組CD3＋T、CD4＋T細胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值上升（P＜0.01），CD8＋T細胞亞群比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組CD3＋T、CD4＋T 細胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值降低（P＜0.01），CD8＋T 細胞亞群比例上升（P＜0.01）。對脾臟Th1 細胞亞群分析，結果如圖3B 所示，與正常組比較，模型組Th1 比例上升（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組Th1 比例下降（P＜0.01），典型流式圖見圖3C。

圖3 各組小鼠脾臟T 淋巴細胞亞群變化（±s， n＝8）

3.5 益神顆粒對免疫抑制小鼠外周血T 淋巴細胞亞群的影響 如圖4A 所示，與正常組比較，模型組CD3＋T、CD4＋T細胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值上升（P＜0.01），CD8＋T細胞亞群比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒高劑量組CD3＋T、CD4＋T 細胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值降低（P＜0.01），CD8＋T 細胞亞群比例上升（P＜0.01），典型流式圖見圖4B。

圖4 各組小鼠外周血淋巴細胞亞群變化（±s， n＝8）

3.6 益神顆粒對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響

3.6.1 多樣性分析 α 多樣性指數可評估腸道菌群的多樣性和豐富度，本研究以Shannon 和Ace 指數為標準，進行差異分析。如圖5A～5B 所示，各組之間Shannon 和Ace 指數無明顯變化（P＞0.05），提示短期使用CTX 對小鼠腸道菌群的多樣性和豐度無影響。β 多樣性利用各樣本序列間的進化關系及豐度信息來計算樣本間距離，反映樣本（組）間是否具有顯著的微生物群落差異。如圖5C 所示，模型組腸道菌群與正常組存在差異（P＞0.05），說明CTX 可引起小鼠腸道菌群物種組成發生變化；益神顆粒低劑量干預后，免疫抑制小鼠腸道菌群趨向正常組。

圖5 腸道菌群多樣性分析（±s， n＝5）

3.6.2 物種組成分析 如圖6A 所示，門水平上Bacteroidota和Firmicutes是小鼠腸道菌群的主要組成部分，占菌群總數的90% 以 上，其次是Campilobacterota和Patescibacteria等。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間物種組成差異，結果見圖6B，將相對豐度排名前4 的細菌展開分析，如圖6C～6F 所示，與正常組比較，模型組Bacteroidota相對豐度降低（P＜0.05）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組Bacteroidota相對豐度增加（P＜0.05，P＜0.01）。Firmicutes／Bacteroidota（F／B）比值被用來評估腸道菌群的平衡，CTX 使得F／B 值增大，引起腸道菌群異常，而益神顆粒可在一定程度上逆轉該趨勢。

圖6 門水平上的物種組成和差異分析（±s， n＝5）

如圖7A 所示，在屬水平上norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus為優勢菌屬，在正常小鼠腸道菌群中占50%以上。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間物種組成差異，結果見圖7B，將相對豐度排名前4 的菌屬展開分析，如圖7C～7F 所 示，與正常組比較，模型組norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus相對豐度降低（P＜0.01），Lachnospiraceae＿NK4A136＿group相對豐度升高（P＜0.05）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組norank＿f＿Muribaculaceae相對豐度升高（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組Lactobacillus相對豐度升高（P＜0.01）。

圖7 屬水平上的物種組成和差異分析（±s， n＝5）

4 討論

本研究從臟器指數、T 細胞亞群和腸道菌群3 個方面探究益神顆粒的藥效作用。CTX 作為烷基化抗癌藥物，殺傷腫瘤細胞的同時也會損傷宿主的免疫器官和免疫細胞［5-7］。本研究表明，益神顆粒在一定程度上保護免疫器官，增加WBC 和BMNC 數目，提高淋巴細胞增殖能力。T細胞亞群分析結果顯示，CTX 處理后，小鼠體內CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T 以及Th1 比例上升，與文獻報道基本一致［8-10］；益神顆粒干預后，上述指標向正常組偏移，說明益神顆粒能在一定程度上調節CTX 導致的T 細胞亞群比例失調。其中Th1 比例升高可能與以下2 點有關，一是CTX破環免疫抑制性T 細胞［8，11］，促進Th1 的分化；二是CTX破壞腸道內環境平衡，導致黏膜通透性增加，細菌或其成分（LPS）易位［12］。

益神顆粒作為由靈芝、黃芪、黃精、當歸和何首烏組成的中藥復方制劑，富含多糖成分。植物多糖作為腸道微生態調節劑，具有調節腸道菌群比例，促進腸黏膜修復，增強腸黏膜分泌型免疫球蛋白表達及調節細胞因子水平等作用［10，13-15］。采用16S rRNA 測序技術，對小鼠的腸道菌群進行分析，結果顯示，益神顆粒能夠在一定程度上恢復CTX 造成的菌群組成失調。門水平上，益神顆粒能夠恢復優勢菌群Bacteroidota相對豐度，Bacteroidota作為有益菌［15］，能夠促進腸道淋巴組織的發育，其代謝產物對激活T 細胞依賴的免疫反應至關重要［16］。屬水平上，益神顆粒部分恢復了norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus菌屬比例，norank＿f＿Muribaculaceae為新確立的菌屬名，屬于Bacteroidota，其具體功能尚無深入研究［17］；Lactobacillus也是有益菌［18］，能夠通過固有免疫和適應性免疫調節宿主免疫，與腸道健康密切相關［19-20］。此外，腸道菌群與消化吸收有關，能夠為宿主提供能量，益神顆粒對腸道菌群的正向調節作用在增強宿主營養攝入方面也有重要作用。

綜上所述，益神顆粒能夠改善CTX 誘導的小鼠免疫功能異常，恢復T 細胞水平。另外，益神顆粒能夠調節腸道菌群，使CTX 處理后的小鼠菌群趨于正常，這對于小鼠免疫水平和營養吸收都有重要作用。本研究尚未對腸道菌群與宿主免疫水平的具體相關性進行研究，僅初步摸索了益神顆粒在T 細胞和腸道菌群等方面的調節作用，還需進行更深一步的研究。