基于p38MAPK、AMPK 探討華蟾毒精殺傷人肝癌細胞的機制

曹 秀，向遠彩，鄧程鳳，代榮陽，劉友平

（西南醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，四川 瀘州 646000）

原發(fā)性肝癌主要為肝細胞癌（占75%～85%），是全球第6 大最常見的惡性腫瘤，致死率居第4 順位，每年新發(fā)病例超過84 萬，其中50%發(fā)生在中國［1］。肝癌目前主要的治療手段有切除移植、放化療和外科手術綜合治療。多數患者因發(fā)病隱匿，通常在晚期確診且合并肝硬化，治療選擇受到限制，預后較差［2-3］。近年來，中藥以其來源廣泛、價格低廉、毒副作用較低等優(yōu)點，被普遍用于實驗研究和臨床。華蟾毒精是中藥蟾酥的主要活性成分之一，具有抑制腫瘤增殖和血管形成，誘導腫瘤細胞凋亡的作用［4］。大量研究發(fā)現，華蟾毒精對肝癌［5-6］、前列腺癌［7］、結直腸癌［8］等都具有殺傷作用，但其具體的抗腫瘤機制還缺乏深入的認識。已有研究表明，華蟾毒精可通過激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路誘導胃癌［9］、骨肉瘤細胞凋亡［10］，而p38MAPK 又可作為腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路的下游分子誘導骨肉瘤細胞凋亡［11］。因此，本實驗采用華蟾毒精處理肝癌細胞系SKHep1 和HepG2，通過檢測凋亡標志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、DNA損傷標志蛋白磷酸化的組蛋白H2AX（γ-H2AX）、pp38MAPK 及p-AMPK 等表達，以研究華蟾毒精對肝癌細胞的殺傷作用機制，為華蟾毒精治療肝癌提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑 華蟾毒精（純度98.90%，CAS 號470-37-1）購自美國MedChemExpress 公司。Lipofectamine3000轉染試劑購自美國Invitrogen 公司；1×OptiMEM 無血清培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；乳酸脫氫酶細胞（LDH）毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PARP、γ-H2AX、H2AX、p-p38、p38、p-AMPK、AMPK 一抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購自美國Santa Cruz 公司；陰性對照（NC）-siRNA、AMPKα1-siRNA、p38MAPK-siRNA 購自上海吉瑪制藥技術有限公司，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；低溫離心機（美國Thermo 公司）；酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；紅外發(fā)光成像系統(tǒng)（美國LI-COR 公司）；電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞SK-Hep1 和HepG2 購自中國科學院上海細胞庫，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃加濕孵箱中培養(yǎng)，細胞單層貼壁生長，視具體狀態(tài)更換培養(yǎng)基。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）法檢測細胞毒性 取對數期肝癌細胞接種到96 孔板中，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入不同濃度華蟾毒精（5、10、25、50 nmol／L），以DMSO 為空白對照，不做任何處理為最大酶活性對照孔，每個濃度設置3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測前1 h，在最大酶活性對照孔中加入LDH 釋放液后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后將96 孔板在400×g條件下離心5 min，各孔取80 μL 上清液加入到新的96 孔板中，再向每孔中加入30 μL LDH 工作液，混勻后室溫避光孵育30 min，用酶標儀在490 nm 波長處檢測吸光度值。

2.3 siRNA 轉染 將細胞接種在6 孔板中，待融合度達70%～80% 時，PBS 洗2 次，每孔加入800 μL Opti-MEM。將2.5 μLNC／ AMPKα1／p38MAPK-siRNA 與100 μL 無血清培養(yǎng)液的1×Opti-MEM 混合，同時將4 μL Lipofectamine 3000 轉染試劑與100 μL Opti-MEM 混合，靜置5 min，將2種溶液混合靜置15 min 后，加入到對應的孔內，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h 后，用DMSO或50 nmol／L 華蟾毒精處理12 h，收集細胞用于Western blot 檢測。

2.4 Western blot 法檢測細胞PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達 取對照組（DMSO）、華蟾毒精組（5、10、25、50 nmol／L）及干擾AMPK／p38MAPK ＋華蟾毒精（50 nmol／L）組的肝癌細胞，用IP 裂解液于冰上提取細胞總蛋白，超聲破碎，4 ℃離心后，采用BCA 法進行蛋白定量，具體操作按照試劑盒說明書進行，將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，通過SDS-PAGE 凝膠電泳、濕轉、封閉、切膜，加入一抗于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗室溫避光孵育1 h，TBST 洗滌3 次，Odessey-CLX 掃描顯影，即得到目的蛋白的免疫印跡圖。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過GraphPad Prism 8.3.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 華蟾毒精對肝癌細胞的影響

3.1.1 華蟾毒精對肝癌細胞毒性的影響 與0 nmol／L 華蟾毒精組比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理12 h后，SK-Hep1 和HepG2 細胞LDH 釋放量均增加，細胞毒性增強，并呈濃度依賴性，見圖1A～1B。隨后選用效果最為顯著的50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細胞6、12 h，與對照組（DMSO）比較，50 nmol／L 華蟾毒精組SKHep1 和HepG2 細胞LDH 釋放量均增加（P＜0.05），細胞毒性增強，并呈時間依賴性，見圖1C～1D。結果表明，華蟾毒精對肝癌SK-Hep1 和HepG2 細胞具有明顯的毒性作用。

圖1 華蟾毒精對肝癌細胞毒性的影響（±s， n＝3）

3.1.2 華蟾毒精對肝癌細胞凋亡和DNA 損傷的影響 與對照組（DMSO）比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細胞12 h 后，凋亡相關蛋白PARP 以及DNA 損傷標志蛋白γ-H2AX 均呈劑量依賴性升高（P＜0.05），見圖2A～2D；50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細胞6、12 h 后，PARP及γ-H2AX 蛋白表達均呈時間依賴性升高（P＜0.05），見圖2E～2H。結果表明，華蟾毒精可以誘導肝癌細胞凋亡和DNA 損傷。

圖2 華蟾毒精對人肝癌細胞凋亡和DNA 損傷的影響（±s， n＝3）

3.1.3 華蟾毒精對肝癌細胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達的影響與對照組（DMSO）比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細胞12 h 后，細胞p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖3A～3D；此外，50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細胞6、12 h 后，p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表達均呈時間依賴性升高（P＜0.05），見圖3E～3H。結果表明，華蟾毒精可激活肝癌細胞p38MAPK 和AMPK 表達。

圖3 華蟾毒精對肝癌細胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達的影響（±s， n＝3）

3.2 干擾p38MAPK 表達后華蟾毒精對肝癌細胞的影響

3.2.1 華蟾毒精通過p38MAPK 誘導肝癌細胞凋亡和DNA損傷 與siNC＋華蟾毒精組比較，sip38＋華蟾毒精組細胞PARP 和γ-H2AX 蛋白表達均降低（P＜0.05），見圖4。結果表明，華蟾毒精通過激活p38MAPK 誘導肝癌細胞凋亡和DNA 損傷。

圖4 華蟾毒精通過p38MAPK 誘導肝癌細胞凋亡和DNA 損傷（±s， n＝3）

3.2.2 干擾p38MAPK 表達后對肝癌細胞中p-AMPK 表達的影響 抑制p38MAPK 基因表達后，p-AMPK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與siNC＋華蟾毒精組比較，sip38＋華蟾毒精組p-AMPK 蛋白表達進一步升高（P＜0.05），見圖5。結果表明，下調p38MAPK 基因的表達可激活肝癌細胞中AMPK表達。

圖5 干擾p38MAPK 后對肝癌細胞中p-AMPK 和p38 蛋白表達的影響（±s， n＝3）

3.3 干擾AMPK 表達后對華蟾毒精誘導肝癌細胞凋亡和DNA 損傷的影響 與siNC＋華蟾毒精組比較，siAMPKα1＋華蟾毒精組肝癌細胞p-AMPK 蛋白表達降低（P＜0.05），PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖6A～6D；乳酸脫氫酶檢測結果顯示siAMPKα1＋華蟾毒精組LDH 水平升高（P＜0.05），見圖6E～6F。結果表明，敲低AMPK 能夠促進華蟾毒精誘導的肝癌細胞凋亡和DNA損傷。

圖6 干擾AMPK 表達后對華蟾毒精誘導肝癌細胞凋亡和DNA 損傷的影響（±s， n＝3）

4 討論

原發(fā)性肝癌是全球癌癥相關發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一，臨床上常用的治療方法均不能有效控制腫瘤的擴散和轉移。廣譜化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會損傷機體的免疫系統(tǒng)，但與中醫(yī)藥結合可提高其治療效果［12-13］。最新肝癌治療指南也推薦了若干種現代中藥制劑用于手術切除后的輔助治療，可顯著緩解化療藥物的副作用，改善晚期肝癌的生存率［14］。華蟾毒精是從中華大蟾酥中提取分離出的主要活性成分，對包括肝癌、結直腸癌、多發(fā)性骨髓瘤［15］等腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用。本研究探索了華蟾毒精對人肝癌細胞系SK-Hep1 和HepG2 的影響及其分子機制。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑及其上游信號轉導，例如MAPK 途徑、PI3K／Akt 途徑、NF-κB 途徑等［16］。多項研究指出，無論是放化療藥物、細胞毒性藥物還是靶向藥，激活腫瘤促凋亡通路是治療肝癌細胞的一條有效途徑［17-18］。本實驗發(fā)現，華蟾毒精可誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。p38MAPK 屬于MAPKs 家族，參與細胞增殖、分化、凋亡等眾多生物學進程，活化的p38MAPK 可以通過降低Bcl-2／Bax 比值，誘導線粒體功能障礙，進而引起細胞凋亡［19］。本研究結果顯示，華蟾毒精上調了肝癌細胞中p-p38MAPK 蛋白表達，提示華蟾毒精殺傷肝癌細胞可能與p38MAPK 通路的激活有關。近年來，p38MAPK 作為一種腫瘤抑制因子引起廣泛的關注，如在HeLa 細胞中p38MAPK 的激活可特異性抑制腫瘤的形成［20］；在化療過程中順鉑可以激活p38MAPK 通路，達到殺傷腫瘤的作用，因此可作為順鉑的特異性治療靶點，具有重要臨床意義［21］。本實驗也發(fā)現，華蟾毒精可激活p38MAPK，而敲低p38MAPK 表達后，華蟾毒精誘導的肝癌細胞凋亡和DNA 損傷效率降低，且p-AMPK 表達呈現上升趨勢，說明在肝癌細胞中華蟾毒精可通過激活p38MAPK 發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，且提示AMPK 也參與其中。

AMPK 作為真核細胞的能量感受器，能夠協(xié)調包括自噬、凋亡、細胞周期和蛋白質合成在內的一系列細胞過程，與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，已成為許多代謝綜合征和腫瘤治療的重要靶點［22］。近年來的諸多研究發(fā)現，AMPK 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮雙重功能［23］，如AMPK 可作為一個腫瘤抑癌因子，負性調節(jié)癌細胞Warburg效應從而抑制腫瘤的生長［24］；又可作為腫瘤的保護因子，通過直接磷酸化CREB1 促進下游HIF1α 的轉錄激活，從而促進葡萄糖代謝，達到加速膠質母細胞瘤生長的作用［25］；也可通過調控不同的信號通路促進結腸癌［26］、乳腺癌［27］的生長。本實驗結果顯示，華蟾毒精可上調肝癌細胞中p-AMPK蛋白表達，進一步研究發(fā)現敲低AMPKα1 后華蟾毒精誘導的肝癌細胞凋亡和DNA 損傷程度增加，pp38MAPK 蛋白表達也升高，表明AMPK 可以保護腫瘤抵抗華蟾毒精的殺傷作用。值得注意的是本研究發(fā)現p38MAPK 與AMPK 之間似乎存在相互調控的關系，有待進一步的實驗驗證。

綜上所述，在華蟾毒精殺傷人肝癌細胞SK-Hep1 和HepG2 的過程中，p38MAPK 的激活可促進肝癌細胞的凋亡和DNA 損傷，而AMPK 的激活可抑制肝癌細胞的凋亡和DNA 損傷，推測在人肝癌細胞中華蟾毒精激活p38MAPK的力度大于AMPK，最終達到殺傷腫瘤的作用。本研究不僅為華蟾毒精治療肝癌的臨床應用提供新的理論基礎，也有望為華蟾毒精治療肝癌提供新的思路。