黃芪甲苷通過NF-κB／NLRP3 信號通路減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥反應(yīng)

孫 洋，王洪新

（錦州醫(yī)科大學(xué)心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001）

肺動脈高壓的特征是血管過度收縮和閉塞性血管重塑，其組織病理學(xué)特征包括肺血管的內(nèi)膜和外膜層增厚，以及血管閉塞和叢狀病變［1-2］，研究表明，在其肺血管系統(tǒng)和右心室中，炎癥因子水平有所增加［3］，提示炎癥在肺動脈高壓中發(fā)揮著重要作用。NLRP3 炎性小體是一種多蛋白促炎復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和位于細胞質(zhì)中的caspase-1 組成［4］。在肺動脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB 的表達增加，此外，終末期特發(fā)性肺動脈高壓患者的肺血管中NF-κB 也被激活，這說明NF-κB 的激活可能促進了該疾病的發(fā)展［5］。

黃芪是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋補的作用，皂苷、類黃酮和多糖等成分被認為是黃芪的主要活性成分［6］。黃芪甲苷是從黃芪中提取的四環(huán)三萜皂苷，對多種心血關(guān)疾病具有保護作用［7］，已有研究表明，黃芪甲苷對肺動脈高壓具有保護作用［8］，但具體改善機制尚不清楚。因此，本實驗在體內(nèi)和體外水平上，分別探討黃芪甲苷對肺動脈高壓的保護作用和潛在機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷（純度≥98.0%，南京景竹生物科技有限公司）。野百合堿、炎癥小體NLRP3 抑制劑MCC950、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 抑制劑Bay11-7082（美國Sigma 公司，貨號 315220、538120、B5556）；GAPDH、NLRP3、NF-κB 抗體（美國Proteintech 公司，貨號60004-1-Ig、19771-1-AP、14220-1-AP）；FITC 熒光染料（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號CSB-L05598m）；Alexa Fluor 488 熒光二抗、BeyoClickTMEdU-488 細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號A0423、C0071S）。

1.2 儀器 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad 公司）；NM-9602G 型酶標分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DMI3000B 型顯微鏡（德國Leica 公司）；制冰機（日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社）。

1.3 動物和細胞 健康雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（200±10）g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2014-0004。人肺動脈內(nèi)皮細胞（HPAECs），購自通派（上海）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組和給藥 將60 只大鼠隨機分為對照組、模型組、MCC950 組（10 mg／kg）、Bay11-7082 組（5 mg／kg）、黃芪甲苷組（40、80 mg／kg），通過單次腹腔注射野百合堿建立肺動脈高壓模型，黃芪甲苷組大鼠連續(xù)灌胃40、80 mg／kg黃芪甲苷28 d，MCC950 組（10 mg／kg）和Bay11-7082 組（5 mg／kg）大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量藥物。

HPAECs 細胞在含10%胎牛血清的ECM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。HPAECs 細胞用野百合堿吡咯誘導(dǎo)24 h，然后用MCC950（10 μmol／L）、Bay 11-7082（10 μg／mL）、黃芪甲苷（50、100 μmol／L）分別處理30 min。

2.2 右心室導(dǎo)管插管法檢測血流動力學(xué) 使用BL-420S 生物信號采集和分析系統(tǒng)，通過右心室導(dǎo)管插管測定右心室收縮壓和平均肺動脈壓。分別測定左心室壁（LV）、室間隔（S）和右心室壁（RV），右心肥厚指數(shù)表示為右心室與左心室加上隔膜的重量比，公式為右心肥厚指數(shù)＝RV／（LV＋S）。

2.3 ELISA 法檢測大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細胞IL-6、TNF-α 水平 按照ELISA 試劑盒說明書測定大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細胞IL-6、TNF-α 水平。

2.4 免疫組化法檢測大鼠肺組織IL-6 蛋白表達 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，切片，經(jīng)熱修復(fù)、封閉后，IL-6 抗體4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素染核，透明后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察到有棕黃色顆粒沉淀即為IL-6 表達，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，蛋白表達為陽性表達面積／總細胞面積。

2.5 免疫熒光法檢測大鼠肺組織NLRP3、NF-κB 蛋白表達 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，高壓抗原修復(fù)，滴加NLRP3、NF-κB 一抗，4 ℃過夜后滴加熒光二抗，DAPI 染核，在熒光倒置顯微鏡下觀察，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，蛋白表達為熒光光密度總和／面積總和。

2.6 EdU-488 增殖試劑盒檢測HPAECs 細胞增殖情況 按照試劑盒說明書進行操作，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，細胞增殖率為EdU-488 光密度總和／面積總和。

2.7 Western blot 法檢測HPAECs 細胞NLRP3、NF-κB 蛋白表達 提取細胞總蛋白后BCA 法測定濃度，將樣品蛋白通過SDS-PAGE 凝膠進行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1.5 h，然后與NLRP3、NF-κB 抗體4 ℃孵育過夜，與二抗室溫孵育2 h，ECL 法顯色，曝光，用Image J 軟件分析結(jié)果。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血流動力學(xué)和體質(zhì)量的影響 與對照組比較，模型組大鼠右心肥厚指數(shù)、右心室收縮壓和平均肺動脈壓均升高（P＜0.01），體質(zhì)量降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠右心肥厚指數(shù)、右心室收縮壓和平均肺動脈壓均降低（P＜0.01），體質(zhì)量升高（P＜0.01），說明黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠的肺動脈高壓有改善作用，見圖1。

圖1 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血流動力學(xué)和體質(zhì)量的影響（±s， n＝6，1 mmHg＝0.133 kPa）

3.2 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清TNFα 水平和肺組織IL-6 表達均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達均降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷能夠減輕肺動脈高壓大鼠炎癥反應(yīng)，見圖2。

圖2 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達的影響（±s， n＝6）

3.3 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號通路的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達均降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠的保護作用可能通過抑制NF-κB／NLRP3 信號通路，見圖3。

圖3 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號通路的影響（±s， n＝6，×400）

3.4 黃芪甲苷對HPAECs 細胞增殖的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞增殖率升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞增殖率降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷能改善HPAECs 細胞增殖情況，見圖4。

圖4 黃芪甲苷對HPAECs 細胞增殖的影響（±s， n＝6，×400）

3.5 黃芪甲苷對HPAECs 細胞炎癥因子TNF-α、IL-6 水平的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 黃芪甲苷對HPAECs 細胞TNF-α、IL-6 水平的影響（±s， n＝6）

3.6 黃芪甲苷對HPAECs 細胞NF-κB／NLRP3 信號通路的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖6。

圖6 黃芪甲苷對HPAECs 細胞NF-κB／NLRP3 信號通路的影響（±s， n＝6）

4 討論

野百合堿可引起肺動脈高壓，單次腹腔注射可建立肺動脈高壓動物模型。在細胞色素P-450（CYP3A4）的作用下，野百合堿在肝臟代謝為吡咯烷（野百合堿吡咯），選擇性地損傷肺動脈內(nèi)皮細胞，最終引起肺動脈高壓［9］。內(nèi)皮細胞增殖和炎癥參與了肺動脈高壓疾病發(fā)展的進程［10］。臨床前研究和人體試驗表明，炎癥在肺動脈高壓中發(fā)揮著重要作用。細胞炎癥因子水平的升高與肺動脈高壓患者不良預(yù)后有關(guān)［11］，在肺動脈高壓患者的血清中，TNF-α、IL-6 水平升高［12-13］；在肺動脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB表達增加，而NF-κB 的激活可能促進了該疾病的發(fā)展［14］。NF-κB 的活化能激活NLRP3 炎性小體，并能誘導(dǎo)NLRP3和pro-IL-1β 的轉(zhuǎn)錄［13］，研究證實，NLRP3 在肺動脈高壓起著重要作用，參與了肺動脈高壓的疾病發(fā)展［15］。由此推測黃芪甲苷可能通過NF-κB／NLRP3 信號通路來減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥反應(yīng)。

實驗結(jié)果表明，黃芪甲苷組能夠降低肺動脈高壓大鼠右心室收縮壓、平均肺動脈壓和右心肥厚指數(shù)，改善肺動脈高壓大鼠體質(zhì)量降低情況，說明黃芪甲苷可以改善肺動脈高壓大鼠血流動力學(xué)和生活質(zhì)量。實驗還發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以改善HPAECs 細胞的增殖情況，下調(diào)肺動脈高壓大鼠血清、肺組織和HPAECs 細胞中IL-6、TNF-α 水平和NFκB、NLRP3 表達，說明黃芪甲苷可在體內(nèi)和體外減輕野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠或HPAECs 細胞的炎癥反應(yīng)。進一步實驗表明，與模型組比較，MCC950 組和Bay11-7082組IL-6、TNF-α 水平和NF-κB、NLRP3 蛋白表達降低，提示MCC950 和Bay11-7082 能夠減輕肺動脈高壓大鼠和HPAECs 細胞中的炎癥反應(yīng)，并且這種作用與黃芪甲苷類似。

綜上所述，黃芪甲苷能夠減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥，其機制可能是通過NF-κB／NLRP3 信號通路發(fā)揮作用。