獨一味配方顆粒藥效學(xué)研究

張 愷黃鈺婷宇文歡莎廖嘉寶*樊官偉*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193； 2.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110； 3.天津市中醫(yī)方證轉(zhuǎn)化研究重點實驗室，天津 300193； 4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

獨一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo 為我國藏族民間傳統(tǒng)藥材，應(yīng)用歷史悠久，具有活血止血、祛風(fēng)止痛功效，臨床上用于治療跌打損傷、外傷出血、風(fēng)濕痹痛等［1-2］。目前獨一味單味制劑共有兩種劑型收錄于2020 年版《中國藥典》，分別為膠囊劑與片劑。運(yùn)用現(xiàn)代制藥工藝技術(shù)將獨一味藥材進(jìn)一步提取加工制成配方顆粒，是獨一味制劑現(xiàn)代化劑型改革的一次有益嘗試。配方顆粒相較于傳統(tǒng)劑型具有調(diào)配靈活、隨證加減、劑量準(zhǔn)確、服用方便等優(yōu)勢，但其療效確切與否目前仍有部分爭議，一定程度上制約了其臨床應(yīng)用與市場推廣［3-4］。因此，中藥配方顆粒的有效性評價是當(dāng)前研究的重點。針對獨一味配方顆粒的藥效學(xué)評價，目前尚缺乏相關(guān)研究報道。本研究以獨一味配方顆粒為研究對象，分別以醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體疼痛模型、福爾馬林致痛小鼠模型以及佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，對獨一味配方顆粒的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血藥效進(jìn)行綜合評價，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 YLS-7C 足趾容積測量儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；NX-102 動物即時凝血分析儀（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司）；Varioskan Lux 多功能微孔板讀數(shù)儀、Legend Micro 21R 冷凍高速離心機(jī)、MaxQ 4450 小型臺式恒溫?fù)u床（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；GENIUS 3 渦旋混合器（德國IKA 公司）；NewClassic MF 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q Integral 5 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 動物 SPF 級雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量18～22 g；SPF級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～200 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（津）2019-0002。實驗動物操作均遵從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會審定的規(guī)范要求。

1.3 藥物與試劑 獨一味配方顆粒由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供（批號2004001Y），每1 g 獨一味配方顆粒相當(dāng)于4 g 飲片；獨一味膠囊購自康縣獨一味生物制藥有限公司（批號1911026305）。布洛芬片（0.1 g／片）購自特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（批號32191204）；云南白藥（4.0 g／瓶）購自云南白藥集團(tuán)股份有限公司（批號ZHA1914）。實驗時取布洛芬片研磨成細(xì)粉（或取云南白藥細(xì)粉），加入蒸餾水與0.5%羧甲基纖維素鈉，配制成所需濃度的混懸液。冰醋酸（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號202005262）；福爾馬林溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號20191213）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（美國Sigma-Aldrich 公司，批號SLCF1289、SLBW2506）。大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）（批號KE20005）、大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（批號KE20001）購自美國Proteintech Group 公司；大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（批號011020200529）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；大鼠α 顆粒膜糖蛋白（GMP-140）（批號CSB-E07399r）、大鼠凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）ELISA 檢測試劑盒（批號CSB-E08432r）購自武漢華美生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

2.1.1 醋酸致小鼠扭體模型 將48 只ICR 小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，獨一味配方顆粒低、高劑量組，獨一味膠囊組，陽性藥組，每組8 只。配方顆粒低、高劑量組小鼠分別灌胃給予0.059、0.29 g／kg 獨一味配方顆粒水溶液；膠囊組灌胃給予0.35 g／kg 膠囊內(nèi)容物水溶液；陽性藥組灌胃給予0.078 g／kg 布洛芬混懸液；空白組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)給藥5 d。于給藥第5 天，末次給藥1 h后，模型組與各給藥組小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL／g，誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)，空白組注射等量生理鹽水。記錄各組小鼠初次發(fā)生扭體反應(yīng)（腹部收縮內(nèi)凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋）的時間，以及20 min 內(nèi)小鼠發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.1.2 福爾馬林致痛小鼠模型 小鼠按“2.1.1” 項下分組、給藥。于給藥第5 天，末次給藥1 h 后，模型組與各給藥組小鼠左后足跖皮下注射5%福爾馬林50 μL，誘發(fā)小鼠舔足反應(yīng)，生理鹽水組注射等量生理鹽水。皮下注射后，立即將小鼠放入燒杯內(nèi)并計時，分別記錄第Ⅰ時相神經(jīng)疼痛期（0～5 min）和第Ⅱ時相炎性疼痛期（15～30 min）小鼠舔（抓咬）左后足的累計時間，計算小鼠舔足反應(yīng)的抑制率。

2.1.3 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型 將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，獨一味配方顆粒低、高劑量組，獨一味膠囊組，陽性藥組，每組8 只。造模第1 天，于大鼠左后足跖與尾根部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL，并于造模第11 天在相同部位皮內(nèi)注射不完全弗氏佐劑0.1 mL 加強(qiáng)免疫。于造模第18 天開始灌胃給藥，配方顆粒低、高劑量組大鼠分別灌胃給予0.041、0.20 g／kg 獨一味配方顆粒水溶液；膠囊組灌胃給予0.24 g／kg 膠囊內(nèi)容物水溶液；陽性藥組灌胃給予0.054 g／kg 布洛芬混懸液；空白組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 足跖腫脹度檢測 分別于造模前、造模第17 天及給藥第7 天，采用足跖容積測量儀測量大鼠左后足跖及無毛區(qū)以下的足跖容積，計算給藥后大鼠足跖腫脹率。

2.3 炎癥因子檢測 于給藥第7 天，足跖腫脹度檢測結(jié)束2 h 后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，室溫放置2 h 后3 500 r／min 低溫離心10 min，分離上層血清，采用ELISA 法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.4 斷尾出血時間檢測 大鼠于末次灌胃給藥1 h 后，固定于固定器，尾部清洗消毒后，距尾尖部10 mm 處橫斷，每隔30 s 用濾紙片吸去血滴1 次，直至出血自然停止，記錄自斷尾起至用濾紙吸至無血時的時間。

2.5 血液凝集參數(shù)檢測 出血時間測定1.5 h 后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，加入枸櫞酸鈉抗凝管，采用凝血分析儀測定大鼠血漿的凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）。

2.6 血小板活化標(biāo)志物檢測 取枸櫞酸抗凝全血，3 500 r／min 低溫離心10 min，分離上層血漿，ELISA 法檢測血漿GMP-140、TAT 水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計前對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布與方差齊性檢驗，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U 檢驗分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 扭體反應(yīng)觀察 與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組與陽性藥組小鼠扭體次數(shù)均減少（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥組小鼠初次扭體時間延長（P＜0.05），見表1。

表1 獨一味對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s， n＝8）

表1 獨一味對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s， n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 舔足反應(yīng)觀察 由表2 可知，與空白組比較，模型組小鼠在第Ⅰ、Ⅱ時相中的舔足反應(yīng)累計時間均延長（P＜0.01），表明動物模型成功建立；與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組、陽性藥組小鼠Ⅱ相舔足反應(yīng)累計時間均減少（P＜0.05）。高劑量獨一味配方顆粒與獨一味膠囊對福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ相舔足反應(yīng)抑制率分別為30.91%、32.17%，高于Ⅰ相抑制率，提示對福爾馬林誘導(dǎo)的Ⅱ相炎性疼痛具有抑制作用，但對Ⅰ相神經(jīng)疼痛的干預(yù)作用有限。

表2 獨一味對福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠疼痛模型的影響（±s， n＝8）

表2 獨一味對福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠疼痛模型的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度 造模后各組大鼠足跖與踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，呈進(jìn)行性加重。與空白組比較，各組大鼠足跖容積均增大（P＜0.01）；與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組與陽性藥組大鼠足跖容積均縮?。≒＜0.05），大鼠足跖腫脹率降低（P＜0.05），提示獨一味配方顆粒可減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足跖腫脹度，改善關(guān)節(jié)炎癥狀，見表3。

表3 獨一味對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝8）

表3 獨一味對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝8）

注：與造模第17 天空白組比較，＃＃P＜0.01；與給藥第7 天空白組比較，??P＜0.01；與給藥第7 天模型組比較，*P＜0.05。

3.4 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子 由圖1 可知，與空白組比較，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），獨一味配方顆粒高劑量組與膠囊組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 獨一味對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）水平的影響（±s， n＝8）

3.5 大鼠斷尾出血時間 由表4 可知，高、低劑量獨一味配方顆粒均能縮短正常大鼠的斷尾出血時間（P＜0.05），提示獨一味配方顆?？砂l(fā)揮一定的止血功效。

表4 獨一味對大鼠出血時間的影響（±s， n＝8）

表4 獨一味對大鼠出血時間的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 血液凝集參數(shù) 凝血四項檢測結(jié)果見表5，獨一味配方顆粒、獨一味膠囊、云南白藥對大鼠PT、TT、APTT 均無顯著影響（P＞0.05）。與空白組比較，各給藥組大鼠FIB值均增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 獨一味對大鼠血液凝集參數(shù)的影響（±s， n＝8）

表5 獨一味對大鼠血液凝集參數(shù)的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.7 血小板活化標(biāo)志物測定 由圖2 可知，與空白組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組、云南白藥組大鼠血漿GMP-140 與TAT 水平均上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），提示促進(jìn)血小板活化可能是獨一味配方顆粒發(fā)揮止血作用的機(jī)制。

圖2 獨一味對大鼠血漿GMP-140（A）、TAT（B）水平的影響（±s， n＝8）

4 討論

本研究選用2 種經(jīng)典的疼痛動物模型探討?yīng)氁晃杜浞筋w粒的鎮(zhèn)痛作用。其中，醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體疼痛模型以低濃度的醋酸作為化學(xué)性致炎因子，通過腹腔注射使小鼠產(chǎn)生劇烈疼痛而出現(xiàn)扭體反應(yīng)，是一種非選擇性外周疼痛模型［5］。結(jié)果顯示獨一味配方顆?？蓽p少醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明獨一味配方顆粒對急性疼痛可發(fā)揮一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。另一方面，福爾馬林致痛模型表現(xiàn)出明顯的兩相疼痛反應(yīng)，Ⅰ相（0～5 min）反應(yīng)為刺激中樞神經(jīng)末梢所致，由福爾馬林的化學(xué)刺激以及注射器的物理刺激引起；Ⅱ相（15～30 min）反應(yīng)則由內(nèi)源性炎癥因子引起，為相關(guān)炎癥介質(zhì)增多所致［6］。模型組小鼠經(jīng)福爾馬林皮下注射誘導(dǎo)出現(xiàn)頻繁且持續(xù)的舔足反應(yīng)［7］。獨一味配方顆粒抑制模型小鼠的Ⅱ相疼痛反應(yīng)，縮短舔足反應(yīng)累計時間，增加舔足反應(yīng)抑制率，證明獨一味配方顆粒具有鎮(zhèn)痛作用，尤其對炎性介質(zhì)參與的疼痛表現(xiàn)出較好的鎮(zhèn)痛藥效。

為了進(jìn)一步探討?yīng)氁晃杜浞筋w粒的抗炎藥效，建立佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型，結(jié)果表明高劑量獨一味配方顆粒可減輕關(guān)節(jié)炎大鼠的足跖腫脹度，降低大鼠足跖腫脹率，緩解關(guān)節(jié)炎癥狀。IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子是滑膜炎癥及關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)［8-9］，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高；獨一味配方顆粒給藥后，大鼠血清IL-6、TNF-α 水平均下調(diào)，提示獨一味配方顆粒可抑制血清炎性因子表達(dá)，發(fā)揮一定的抗炎藥效。環(huán)烯醚萜苷類化合物為獨一味的主要抗炎活性成分［11］，其可通過抑制環(huán)氧合酶活性，減少前列腺素的合成而發(fā)揮抗炎活性［12］。其中，8-乙酰氧基山梔苷甲酯與8-去羥基山梔子苷為代表性化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的抗炎作用［5］。8-乙酰氧基山梔苷甲酯可通過抑制TNF-α 介導(dǎo)的NF-κB 活化，減少炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的合成釋放而發(fā)揮抗炎作用［13］，這可能是獨一味制劑發(fā)揮抗炎作用的重要分子機(jī)制。

在止血藥效方面，獨一味配方顆?？煽s短正常大鼠的斷尾出血時間。PT 主要反映外源性凝血系統(tǒng)功能；APTT可反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能；TT 反映凝血共同途徑狀態(tài)；FIB 則為凝血酶作用的底物［14］。獨一味配方顆?？缮叽笫笱篎IB 水平，但對PT、TT、APTT 無顯著影響，提示獨一味配方顆粒可能通過增加纖維蛋白原水平，影響凝血-纖溶系統(tǒng)而發(fā)揮止血功效。另外，獨一味配方顆?？缮险{(diào)大鼠血漿GMP-140 與TAT 水平。GMP-140 存在于血小板α顆粒內(nèi)，是反映血小板活化程度的特異性指標(biāo)［15］。TAT 則是體內(nèi)凝血和抗凝血相互作用的產(chǎn)物，是凝血酶生成的標(biāo)志物之一［16］。以上結(jié)果提示獨一味配方顆粒的止血機(jī)制可能與升高大鼠血液FIB 水平，上調(diào)血漿GMP-140 與TAT 水平相關(guān)。

綜上所述，獨一味配方顆?？梢种拼姿崤c福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠疼痛反應(yīng)，減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足跖腫脹度，下調(diào)大鼠血清IL-6 與TNF-α 水平，并可縮短正常大鼠的斷尾出血時間，調(diào)節(jié)大鼠血液FIB 與血漿GMP-140、TAT 水平，其中高劑量配方顆粒的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血藥效與獨一味膠囊等效。該研究為獨一味配方顆粒的臨床應(yīng)用提供了一定的藥效學(xué)依據(jù)。