天然甜味劑羅漢果甜苷的研究進(jìn)展

戴 勝，汪惠麗

（1.安徽中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，安徽 蕪湖 240001； 2.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230009）

羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey 是一種葫蘆科多年生藤本植物的果實(shí)，主產(chǎn)于廣西，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)和藥用植物［1］。羅漢果性涼味甘，作為傳統(tǒng)藥材在民間使用已經(jīng)有三百多年的歷史，具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音、滑腸通便的功效［2-3］。

目前，從羅漢果中已分離得到一百多個(gè)化合物，包括46 個(gè)三萜、7 個(gè)黃酮、19 個(gè)氨基酸、2 個(gè)多糖等［4］。羅漢果甜苷是羅漢果的主要活性成分，它是一種葫蘆烷三萜苷類(lèi)化合物，又名羅漢果提取物、羅漢果甜苷、羅漢果皂苷等［5］。同時(shí)，羅漢果甜苷也是羅漢果甜味的主要成分。1975 年，Lee［6］研究確定葫蘆烷三萜糖苷是甜味的主要成分。1983 年，首次從羅漢果中分離得到羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、羅漢果甜苷Ⅵ，此后相繼從羅漢果中分離到三十余個(gè)類(lèi)似化合物［7-8］。這些化合物都以羅漢果醇為苷元，接有不同數(shù)目的糖基，見(jiàn)圖1。天然甜味劑羅漢果甜苷甜度高、熱量低，相比于人工甜味劑后苦味少、安全性好，還具有降血糖作用，是蔗糖的理想替代品。現(xiàn)已被美國(guó)、日本、澳大利亞、新西蘭等多國(guó)列入食品添加劑名單［5］。本文對(duì)羅漢果甜苷的甜味構(gòu)效關(guān)系、周期性變化、生物合成途徑、降糖作用及其他生物活性、安全性進(jìn)行綜述，以期為羅漢果甜苷作為天然甜味劑的應(yīng)用提供進(jìn)一步參考。

圖1 羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)

1 甜味構(gòu)效關(guān)系

羅漢果甜苷按羅漢果醇上葡萄糖基的連接位置、數(shù)目及方式不同命名為羅漢果甜苷Ⅲ、羅漢果甜苷ⅢE、羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ、羅漢果新苷、賽門(mén)苷Ⅰ等，其中以羅漢果甜苷Ⅴ含量最高［9］，見(jiàn)表1。Murata 等［10］進(jìn)行感官測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅲ、羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、賽門(mén)苷Ⅰ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ分別相當(dāng)于蔗糖甜度的195、300、378、465、68 倍。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，羅漢果甜苷是以羅漢果醇為苷元，在C-3、C-24 位上通過(guò)苷鍵連有葡萄糖基，其甜味與結(jié)構(gòu)的關(guān)系為①糖基數(shù)目，要保持甜味，C-3、C-24 位上所接糖基總數(shù)目不得少于3 個(gè)；②11 位取代基的氧化狀態(tài)，11 位羥基如果是α 構(gòu)型為甜味；如果是β 構(gòu)型為無(wú)味，11 位羥基如果被氧化則為苦味［11-13］。此外，賽門(mén)苷Ⅰ雖然只連有4個(gè)糖基，但是它的甜度卻遠(yuǎn)高于同樣含有4 個(gè)糖基的羅漢果甜苷Ⅳ。因而結(jié)構(gòu)中糖基連接位置對(duì)羅漢果甜苷甜味的影響也值得進(jìn)一步研究。常見(jiàn)羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)信息見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)信息

2 周期性變化及生物合成

成熟的羅漢果果實(shí)是甜味的，然而其幼果卻是苦味的，提示羅漢果果實(shí)中苷類(lèi)成分的含量在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生變化。Murata 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，成熟的羅漢果中甜味苷含量高于未成熟的羅漢果。李典鵬等［14］采用薄層色譜法研究不同生長(zhǎng)日齡羅漢果苷類(lèi)成分變化，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)日齡小于30 d的幼果主要含有苦味的羅漢果甜苷ⅡE；羅漢果甜苷Ⅲ在30 d 后開(kāi)始出現(xiàn)，并在55 d 時(shí)含量達(dá)到高峰，并有羅漢果甜苷Ⅳ生成，羅漢果甜苷Ⅳ含量在70 d 達(dá)到最高；85 d 以后，羅漢果甜苷Ⅴ為羅漢果的主要甜味成分。盧鳳來(lái)等［15］通過(guò)RP-HPLC 法研究不同生長(zhǎng)時(shí)期羅漢果，發(fā)現(xiàn)10 d 時(shí)羅漢果內(nèi)苦味苷（羅漢果甜苷ⅡE、11-O-羅漢果甜苷ⅡE）含量最高；55 d 以后則以甜味苷羅漢果甜苷Ⅴ為主；65 d 以后羅漢果甜苷Ⅴ含量變化不大。除羅漢果甜苷Ⅴ外，所有苷類(lèi)含量變化都呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，植物中三萜皂苷的生物合成中低聚糖鏈很可能是按順序?qū)翁欠肿蛹拥杰赵虾铣傻模?6］，提示羅漢果苷在生長(zhǎng)周期中由苦味的低糖苷向甜味的高糖苷進(jìn)行單一方向的轉(zhuǎn)變。

Itkin 等［17］根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，完整解析羅漢果甜苷Ⅴ在羅漢果果實(shí)內(nèi)的生物合成途徑，其在果實(shí)內(nèi)的生物合成基本可以分為2 個(gè)步驟，即羅漢果醇的形成和糖基化。首先是羅漢果醇的生成，乙酰輔酶A 經(jīng)甲羥戊酸途徑生成角鯊烯，角鯊烯在角鯊烯環(huán)氧化酶、葫蘆二烯醇合成酶、環(huán)氧水解酶的依次作用下生成24，25-二羥基葫蘆二烯醇，在CYP87D18 作用下羥基化生成羅漢果醇。而在接下來(lái)的糖基化過(guò)程中，羅漢果醇先是在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT720-269-1 的作用下生成苦味苷（羅漢果甜苷ⅠA1、羅漢果甜苷ⅡE）。羅漢果甜苷ⅡE 在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT94-289-3 的作用下糖基化形成甜味苷羅漢果甜苷ⅢX、羅漢果甜苷ⅣA、賽門(mén)苷Ⅰ，最后生成羅漢果甜苷Ⅴ，生物合成途徑見(jiàn)圖2。而在該生物合成途徑中影響糖基化作用的關(guān)鍵酶UGT720-269-1、UGT94-289-3 表達(dá)具有時(shí)間差異性。UGT720-269-1在幼果中高度表達(dá)，隨著果實(shí)成熟而下降。而UGT94 酶家族則是在發(fā)育后期表達(dá)升高。這與之前幼果中主要成分為羅漢果甜苷ⅡE 等低糖苷，在果實(shí)發(fā)育后期高糖苷不斷增加，最后羅漢果甜苷Ⅴ成為成熟果實(shí)中主要成分的報(bào)道相一致。

圖2 羅漢果甜苷Ⅴ生物合成途徑

綜上所述，羅漢果一般要等到65 d 以后果實(shí)開(kāi)始成熟的時(shí)候進(jìn)行采摘，在加工過(guò)程中不得將未成熟和成熟水果的提取物混合使用，否則都會(huì)降低其中羅漢果甜苷的含量從而影響提取物的質(zhì)量。

3 降糖作用

研究表明，羅漢果甜苷不僅對(duì)控制血糖有效，還能預(yù)防糖尿病相關(guān)的慢性并發(fā)癥，其降糖機(jī)制可分為修復(fù)胰腺損傷，促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗，抗氧化應(yīng)激，抑制α-葡萄糖苷酶活性。

3.1 修復(fù)胰腺損傷，促進(jìn)胰島素分泌 四氧嘧啶可以通過(guò)產(chǎn)生自由基、抑制葡萄糖激酶等作用損害胰島β 細(xì)胞，抑制胰島素原合成，引起1 型糖尿病［18］。張俐勤等［19］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷提取物可以通過(guò)減弱四氧嘧啶對(duì)胰島β 細(xì)胞的損傷或改善受損傷細(xì)胞的功能來(lái)達(dá)到降糖目的，其主要活性成分可能為羅漢果甜苷。Qi 等［20］研究表明，羅漢果甜苷提取物可以有效改善糖尿病小鼠胰島細(xì)胞形態(tài)，增加胰島細(xì)胞數(shù)量，減輕四氧嘧啶所致小鼠胰島β 細(xì)胞損傷，改善代謝紊亂。周英等［21］以大鼠胰島β 細(xì)胞瘤細(xì)胞RIN-5F為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)羅漢果提取物和羅漢果甜苷Ⅴ可以促進(jìn)胰島素的分泌。

3.2 改善胰島素抵抗 胰島素抵抗是指胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，是2 型糖尿病的主要病理特征，降低胰島素抵抗可以延緩糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展。Liu 等［22］用鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)C57BL／6 小鼠構(gòu)建2 型糖尿病模型，研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷提取物可以改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗，表現(xiàn)為胰島素抵抗指數(shù)降低，胰島素敏感性指數(shù)升高。另有研究報(bào)道，通過(guò)TLR4 途徑激活c-Jun N 末端激酶（TLR4-JNK）和氧化應(yīng)激都可以介導(dǎo)胰島素抵抗［23-24］，羅漢果甜苷ⅢE 可以阻斷TLR4-JNK 信號(hào)通路［25］。

3.3 抗氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）損傷機(jī)體組織細(xì)胞及蛋白等生物大分子。ROS 在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中除了能誘發(fā)胰島素抵抗外，還能直接損傷胰島β 細(xì)胞，最終引發(fā)或加重糖尿病［24］。朱慧玲等［26］研究表明，羅漢果皂苷預(yù)處理可以減少乙醇損傷L-02 細(xì)胞活性氧和自由基的過(guò)量積累，降低氧化應(yīng)激，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。鄒健等［27］對(duì)羅漢果皂苷粗提物的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有較好的清除自由基（DPPH、ABTS、ORAC）、鐵離子還原（FRAP）、抗油脂氧化的能力，且抗氧化能力隨著濃度的增加而增加。Chen 等［28］研究羅漢果甜苷體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)氧自由基（O2－、H2O2、·OH）和DNA 氧化損傷具有抑制作用，其中羅漢果甜苷Ⅴ對(duì)清除·OH 更加有效，而11-O-羅漢果甜苷Ⅴ對(duì)O2－、H2O2具有更高的清除率。此外，11-O-羅漢果甜苷Ⅴ對(duì)·OH 誘導(dǎo)的DNA 損傷具有抑制作用。張俐勤等［19］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷提取物在體內(nèi)可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）的生成，提高其抗氧化酶系統(tǒng)SOD、GSH-Px 活性。

3.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性 α-葡萄糖苷酶的主要功能為水解葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖。抑制小腸黏膜α-葡萄糖苷酶活性可以減慢糖類(lèi)水解及產(chǎn)生葡萄糖的速率并延緩葡萄糖的吸收從而降低餐后血糖，該方法對(duì)2 型糖尿病的防治具有重要作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)期羅漢果提取物對(duì)小鼠餐后血糖生成均有抑制效果，其降糖作用機(jī)制之一是羅漢果皂苷提取物能直接抑制α-葡萄糖苷酶活性，其抑制作用與劑量呈正相關(guān)［30-31］。

3.5 其他 研究表明，羅漢果皂苷提取物激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可能有助于抑制糖尿病小鼠糖異生從而達(dá)到降低血糖目的［22］。另有研究報(bào)道，羅漢果皂苷提取物可以降低細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 水平，同時(shí)升高細(xì)胞因子IL-4 水平，從而改善糖尿病小鼠的細(xì)胞免疫失衡達(dá)到控制糖尿病的目的［20］。此外，羅漢果皂苷提取物可以通過(guò)提高糖尿病小鼠血清高密度脂蛋白水平，使血脂水平趨向正常，防止糖尿病引起的脂類(lèi)代謝紊亂，對(duì)糖尿病并發(fā)癥有防治作用［19］。

綜上所述，羅漢果甜苷不僅對(duì)1 型和2 型糖尿病都有很好的防治效果，還能有效預(yù)防糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥。此外，羅漢果中黃酮、多糖、多酚類(lèi)成分也具有降血糖的活性［32］。

4 其他藥理作用

4.1 止咳祛痰平喘 陳瑤等［33］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷可以降低小鼠的咳嗽次數(shù)，促進(jìn)氣管分泌物產(chǎn)生。劉婷等［34］對(duì)羅漢果鎮(zhèn)咳祛痰的有效成分進(jìn)行篩選，推測(cè)羅漢果甜苷Ⅴ為羅漢果鎮(zhèn)咳的主要活性成分。王勤等［35］建立羅漢果祛痰的譜效關(guān)系模型，結(jié)果表明，羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ與祛痰作用呈正相關(guān)且貢獻(xiàn)較大。Song 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅴ能有效抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。

4.2 保肝作用 肖剛等［37］運(yùn)用四氯化碳和卡介苗加脂多糖分別誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠急性肝損傷和免疫性肝損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷能降低2 種肝損傷模型小鼠血清ALT、AST 活性，升高免疫性肝損傷的肝組織勻漿SOD 活性，降低MDA 水平，并能改善肝組織病理?yè)p傷。肝星狀細(xì)胞HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此誘導(dǎo)活化的HSC 細(xì)胞凋亡是防治纖維化的有效手段［38］。研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷含藥血清對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6 周期具有阻滯作用，能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［39-40］。宋開(kāi)娟等［41］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷在體外可以抑制人肝星狀細(xì)胞LX-2 活化，并能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡。

4.3 抗癌 在胰腺癌的體外和體內(nèi)模型中，羅漢果甜苷Ⅴ通過(guò)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞PANC-1 凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性［42］。羅漢果甜苷ⅣE 劑量依賴(lài)性地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人喉表皮樣癌細(xì)胞Hep-2 增殖和異種移植腫瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)［43］。通過(guò)小鼠體內(nèi)皮膚癌變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ可以有效抑制以過(guò)氧亞硝酸鹽為誘變致癌劑、苯二甲酸作為腫瘤促進(jìn)劑的兩步致癌過(guò)程。而11-O-羅漢果甜苷Ⅴ在以7，12-二甲基苯并［a］蒽作為誘變致癌劑，苯二甲酸作為腫瘤促進(jìn)劑的兩步致癌過(guò)程也同樣表現(xiàn)出抑制作用［44］。

4.4 抗炎抑菌 Di 等［45］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷可以通過(guò)降低炎性關(guān)鍵基因iNOS、COX-2、IL-6 表達(dá)，升高炎癥保護(hù)基因PARP1、BCL2l1、TRP53、MAPK9 表 達(dá)，抑 制RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。同樣，在小鼠耳腫脹模型中，羅漢果甜苷可以通過(guò)降低COX-2、IL-6 表達(dá)，升高PARP1、BCL2l1、TRP53、MAPK9、PPARδ 表達(dá)，抑制12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。何怡［46］對(duì)黔產(chǎn)羅漢果進(jìn)行抗炎抑菌譜效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)11-O-羅漢果甜苷Ⅴ既是羅漢果體內(nèi)抗炎活性主要藥效成分，也是羅漢果對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用主要藥效成分之一。羅漢果甜苷Ⅴ是羅漢果對(duì)糞腸球菌、大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用主要藥效物質(zhì)。

羅漢果甜苷的其他藥理作用見(jiàn)表2。

表2 羅漢果甜苷的藥理作用

5 安全性

蘇小建等［47］研究表明，羅漢果甜苷（甜苷含量為81.6%）灌胃對(duì)小鼠的LD50值大于10 000 mg／kg，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。灌胃給予家犬羅漢果甜苷3.0 g／kg（相當(dāng)于人用量的360 倍）4 周，家犬的生化指標(biāo)以及組織器官的形態(tài)學(xué)變化均無(wú)明顯的影響。Jin 等［48］對(duì)Wistar 大鼠進(jìn)行重復(fù)劑量亞慢性毒性研究，發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷各劑量組大鼠在13 周內(nèi)均未見(jiàn)死亡且機(jī)體各項(xiàng)指標(biāo)正常。由此推測(cè)，人的不良反應(yīng)水平男性為每天2 520 mg／kg，女性為每天3 200 mg／kg或更高。另有研究指出，灌胃給予小鼠羅漢果甜苷0.25、0.5、1 g／kg 無(wú)生殖與遺傳毒性，但當(dāng)灌胃劑量達(dá)到5 g／kg時(shí)，雄性小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率與精子畸形率高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）［49］。因此，羅漢果甜苷是否具有遺傳毒性還有待進(jìn)一步的研究，其使用劑量也需要得到關(guān)注。

6 結(jié)語(yǔ)

隨著人們生活水平的提高，糖尿病、肥胖等代謝性疾病已成為人類(lèi)身體健康的重要威脅，因而高甜度、低熱量的人工甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域替代蔗糖。但近年來(lái)，隨著人工甜味劑的普及，其安全性備受質(zhì)疑［50］。有研究報(bào)道，人工甜味劑的攝入會(huì)導(dǎo)致人們對(duì)糖的渴望和依賴(lài)，熱量補(bǔ)償受損導(dǎo)致食欲刺激，攝入增加，體重增加和葡萄糖不耐受［51-53］。宋曉婉［54］研究證實(shí)，天然甜味劑羅漢果甜苷在改善系統(tǒng)性糖耐受和胰島素敏感性方面的效果要顯著優(yōu)于人造甜味劑阿斯巴甜。另外在口感上，人工甜味劑會(huì)產(chǎn)生令人不快的后苦味。羅漢果甜苷提取物的苦味與糖精和安賽蜜相比較少［10］。綜合考慮，植物來(lái)源的天然甜味劑羅漢果甜苷甜度高、熱量低、安全性好、后苦味少，是蔗糖的理想替代品。此外，羅漢果甜苷還具有降血糖、止咳祛痰平喘、保肝等多種功效，因此，對(duì)其進(jìn)行甜味劑、保健品和藥品的開(kāi)發(fā)對(duì)于促進(jìn)公眾健康具有重要意義。

目前羅漢果甜苷已在乳品飲料、固體飲料等食品行業(yè)中得到應(yīng)用，但仍然面臨幾方面的問(wèn)題，①由于不加選擇進(jìn)行人工授粉等原因，目前羅漢果推廣應(yīng)用的品種種類(lèi)繁多，種質(zhì)總體質(zhì)量不夠理想，仍有較大的遺傳改良空間［55］；②羅漢果甜苷的種類(lèi)和含量在生長(zhǎng)過(guò)程中存在周期性變化，因而需要確定一種可以定量測(cè)定羅漢果甜苷的方法來(lái)加強(qiáng)質(zhì)量控制；③目前羅漢果甜苷的相對(duì)甜度測(cè)定還是需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的評(píng)定人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，電子舌無(wú)法替代［56］，其評(píng)測(cè)流程復(fù)雜，結(jié)果存在一定的主觀性；④羅漢果甜苷提取成本高，價(jià)格貴，因此深入了解羅漢果甜苷的生物合成機(jī)制，利用細(xì)胞工廠生產(chǎn)羅漢果甜苷是量產(chǎn)羅漢果甜苷的潛在途徑之一；⑤羅漢果甜苷作為藥品的屬性有待開(kāi)發(fā)，其成分復(fù)雜，具體藥效成分的研究有待進(jìn)一步深入，以促使藥品和保健品的開(kāi)發(fā)。