一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定沙芪濃縮丸中5 種黃酮

薩出拉，王秀枝，楊立國(guó)包書(shū)茵*，奧烏力吉*

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3.通遼職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蒙藥沙芪濃縮丸中君藥沙蓬是藜科植物沙蓬A(yù)griophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分，為蒙古族習(xí)用藥材，蒙文名楚力格日，具有祛疫、清熱、解毒、利尿等功能［1-2］，用于治療“疫熱增盛，身目黃疸，尿道灼痛，腎熱”［3-4］。沙蓬種子是藥食同源物，迄今已中分離得到黃酮、三萜皂苷、生物堿、酚苷等化合物［5-7］，研究表明，其皮中的黃酮類(lèi)成分蘆丁、異槲皮苷、異葒草素具有較強(qiáng)的清除自由基DPPH 的能力［8］；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有顯著降血糖活性，并且水提物、醇提物可顯著降低糖尿病大鼠血糖、血脂，改善糖耐量［9-11］，另外該藥材對(duì)糖尿病肝損傷也有良好的抑制作用［12-13］。目前，正逐步研發(fā)沙蓬與不同藥物配伍而具有抗氧化、抗炎、改善肝腎功能功效的新藥［14］，但尚無(wú)沙芪濃縮丸中多成分含量同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。

王智民等［15］首次提議，采用一測(cè)多評(píng)法對(duì)中藥進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制，它是采用1 種易得對(duì)照品作為內(nèi)標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多成分含量同時(shí)測(cè)定的手段［16-18］。本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測(cè)定沙芪濃縮丸中毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素5 種黃酮的含量，以期為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent Technologies 公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；ZDHW 調(diào)溫電熱套（河北中興偉業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；CCA-112 冷卻水循環(huán)裝置（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；TDI0001A、YP10001 電子天平（上海佑科儀器表有限公司）；KQ-C20 玻璃儀器氣流干燥器、R-1010 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；UPH-I-20L 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；LDZ4-0.8 離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)）；DHG-9145A 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；T-1200N 馬弗爐（鄭州天縱電器設(shè)備有限公司）；錐形瓶；蒸發(fā)皿；硅膠G 薄層板；稱(chēng)量瓶；量瓶；無(wú)灰濾紙；坩堝。

1.2 試劑與藥物 沙芪濃縮丸（自制，批號(hào)202009、202105、202106）。毛蕊異黃酮苷（純度＞98%，CAS 號(hào)20633-67-4，批號(hào)B20847）、水仙苷（純度＞98%，CAS 號(hào)604-80-8，批號(hào)B2179）、異鼠李素（純度＞98%，CAS 號(hào)78-70-6，批號(hào)B21554）、銀鍛苷（純度＞98%，CAS 號(hào)20316-62-5，批號(hào)B21578）、芒柄花素（純度＞98%，CAS 號(hào)485-72-3，批號(hào)B20836）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Welch LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.4% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～15 min，15%～38% A；15～25 min，38%～42% A；25～30 min，42%～82%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見(jiàn)圖1。由此可知，各黃酮色譜峰分離度均大于1.5。

圖1 各黃酮HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various flavonoids

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素對(duì)照品1.25、1.47、1.23、1.96、2.47 mg，25 mL 70%甲醇搖勻溶解，分別制成每1 mL 分別含各成分0.025、0.029、0.024、0.039 2、0.049 mg 的 溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過(guò)4 號(hào)篩）約1 g，加50 mL 90% 甲醇（含1% 甲酸），超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理60 min，濾過(guò)，取25 mL 濾液，在40～50 ℃下蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中并定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，稀釋成不同質(zhì)量濃度（水仙苷0.029 4、0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 mg／mL，銀鍛苷0.024 6、0.049 2、0.098 4、0.147 6、0.196 8、0.246 mg／mL，毛蕊異黃酮苷0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg／mL，異鼠李 素0.039 2、0.078 4、0.156 8、0.235 2、0.313 6、0.392 mg／mL，芒柄花素0.049 4、0.098 8、0.197 6、0.296 4、0.395 2、0.494 mg／mL），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 各黃酮線(xiàn)性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積 RSD 分別為 0.13%、0.17%、0.02%、0.07%、0.07%，表明儀器精密度較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積RSD 分別為 0.86%、0.77%、0.89%、1.90%、1.10%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批本品粉末（批號(hào)202009）0.5 g，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積RSD 分別為1.57%、1.93%、1.24%、1.13%、1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批本品粉末（批號(hào)202009）6 份，每份0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密量取含毛蕊異黃酮苷1.0 mg、水仙苷1.2 mg、銀鍛苷0.3 mg、異鼠李素0.4 mg、芒柄花素0.3 mg 的對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素平均加樣回收率分別為95.80%、98.08%、91.90%、94.66%、99.82%，RSD 分別為0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%。

2.5 相對(duì)校正因子考察

2.5.1 計(jì)算方法 取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊異黃酮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他4 種黃酮的相對(duì)校正因子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各黃酮相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors for various flavonoids

2.5.2 耐用性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters e2695、Agilent 1260 色譜儀及 Welch LP-C18、Agilent ZORRA plus-C18、Venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表3，可知均無(wú)明顯影響（RSD ＜2.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.3 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了體積流量0.3、0.5、0.8、1 mL／min 對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫25、30、35、40、45 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜2.0%）。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.5 不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液對(duì)相對(duì)校正因子的影響 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，依次稀釋至0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mg／mL，考察它們對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表6，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜2.0%）。

表6 不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.6 Effects of different concentrations of reference solutions on relative correction factors

2.5.6 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液4 份，分別在252、254、256、260 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)，考察它們對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表7，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜2.0%）。

表7 不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.7 Effects of different detection wavelengths on relative correction factors

2.5.7 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，每批3 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表8。由此可知，2 種方法所得結(jié)果接近［相對(duì)平均偏差（RAD）＜2%］，表明一測(cè)多評(píng)法可用于本實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定。

表8 各黃酮含量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.8 Results of content determination of various flavonoids（mg／g， n＝3）

3 討論

沙芪濃縮丸以沙蓬為君藥，黃芪為臣藥，兩者均含黃酮類(lèi)成分［19-20］，具有抗炎、抗氧化、抑制糖尿病等作用［21-22］。首先，本實(shí)驗(yàn)考察不同供試品溶液制備方法，包括提取方法（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（30、60、90 min）、提取溶 劑（90%、70%、40%甲醇及無(wú)水甲醇），以各成分提取率為指標(biāo)，最終確定為90% 甲醇超聲提取60 min。然后，篩選不同流動(dòng)相，包括甲醇-水（含0.2%甲酸）、乙腈-水（含0.2% 甲酸）、甲醇-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷 酸）、乙 腈-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷酸），發(fā)現(xiàn)水相中酸濃度較高時(shí)各成分分離度較好，色譜峰峰形明顯改善，最終確定為乙腈-水（含0.4%磷酸）。最后，采用DAD 檢測(cè)器在190～400 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)各成分在260、290 nm 處均有吸收峰，以前者更理想，最終確定為260 nm。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定沙芪濃縮丸中毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素5 種黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與外標(biāo)法接近（相對(duì)偏差小于2%），可在相應(yīng)對(duì)照品缺少或難以得到的情況下，以毛蕊異黃酮苷為內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)含量測(cè)定的目的，從而為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。