球等鞭金藻CRY1與COP1互作及生物信息學(xué)分析

李歡 李龍玉 鐘潔 陳由強 余雪冰 何文錦 陳建楠

李歡，李龍玉，鐘潔，等.球等鞭金藻CRY1與COP1互作及生物信息學(xué)分析［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（12）：07-14.

收稿日期：2023-11-02

作者簡介：李歡，女，1999年生，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究。

*通信作者：陳建楠，男，1991年生，碩士，實驗師，主要從事三角褐指藻培育研究（E-mail：381220681@qq.com）。

基金項目：福建省自然科學(xué)基金項目（2023J01509）。

摘? 要：為驗證球等鞭金藻的隱花色素蛋白IgCRY1與下游蛋白IgCOP1是否互作，通過提取球等鞭金藻的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，擴增目的片段，構(gòu)建BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體，共同轉(zhuǎn)入AH109酵母菌株進行酵母雙雜驗證，并對IgCOP1蛋白進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：從球等鞭金藻中克隆到IgCRY1和IgCOP1的CDS序列分別為1560 bp和1185 bp。通過酵母雙雜驗證了IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白相互互作。對互作蛋白IgCOP1進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白的分子量大小為43.7 kDa，編碼的氨基酸個數(shù)為394個，二級結(jié)構(gòu)62.69%為不規(guī)則卷曲，是典型的親水性蛋白。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示IgCOP1蛋白聚于分支底部，與其他分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白相互互作的驗證，為球等鞭金藻的光信號調(diào)控生物學(xué)過程提供了重要的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻；酵母雙雜；IgCRY1蛋白；IgCOP1蛋白；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q 943.2? ???文獻標(biāo)志碼：A? ???文章編號：0253-2301（2023）12-0007-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.002

Interaction and Bioinformatics Analysis of CRY1 and COP1 in Isochrysis Galbana

LI Huan1，2，3，4， LI Long-yu1，2，3，4， ZHONG Jie1，2，3，4， CHE You-qiang1，2，3，4，YU Xue-bing1，2，3，4， HE Wen-jin1，2，3，4， CHEN Jian-nan1，2，3，4*

（1. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Public Service

Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products，

Fuzhou， Fujian 350117， China; 3. Fujian Key Laboratory of Special Marine Bioresource Sustainable

Utilization， Fuzhou， Fujian 350117， China; 4. Fuzhou Institute of Marine Research， Marine Active

Substances and Products Technology R & D Center， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In order to verify whether the cryptochrome protein IgCRY1 of Isochrysis galbana interacted with the downstream protein IgCOP1， the total RNA of Isochrysis galbana was extracted and reverse transcribed into cDNA as a template to amplify the target fragment. The BD-IgCRY1 and AD-IgCOP1 vectors were constructed and co-transfected into the yeast strain AH109 for the yeast two-hybrid verification. And the bioinformatics analysis of IgCOP1 protein was performed. The results showed that the CDS sequences of IgCRY1 and IgCOP1 cloned from Isochrysis galbana were 1560 bp and 1185 bp， respectively. The mutual interaction between IgCRY1 protein and IgCOP1 protein was verified by the yeast two-hybrid system. The bioinformatics analysis of the interacting protein IgCOP1 revealed that the molecular size of the protein was 43.7 kDa， and the number of encoded amino acids was 394， which was a typical hydrophilic protein with 62.69% of its secondary structure irregularly coiled. The phylogenetic tree analysis showed that IgCOP1 protein was clustered at the bottom of the branch， and had a distant relationship with the other branches. The verification of the interactions between IgCRY1 protein and IgCOP1 protein provided an important theoretical basis for the biological process of light signal regulation in Isochrysis galbana.

Key words： Isochrysis galbana； Yeast two-hybrid； IgCRY1 protein； IgCOP1 protein； Bioinformatics analysis

球等鞭金藻是等鞭金藻科，等鞭金藻屬的海洋微藻［1］，適合生長在溫度為22℃、光照強度為75 μmol·m-2·s-1、pH 偏堿性的環(huán)境中［2］。這種微藻的生長速度快、易于培養(yǎng)、個體較小且無細(xì)胞壁［3-4］，這些特點使得它在實驗室研究和大規(guī)模生產(chǎn)中都極具吸引力。球等鞭金藻富含大量的色素、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分對人體健康有很多益處，如抗氧化、降低膽固醇等，因此被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。

隱花色素（Cryptochrome，Cry）是一種重要的藍光受體，它能夠吸收藍光和近紫外光，也能參與植物下胚軸及莖節(jié)的伸長過程，還對開花及生物鐘的光敏調(diào)控起到關(guān)鍵作用［5］。自1979年被Gressel首次發(fā)現(xiàn)以來，Cry在不同領(lǐng)域的研究一直備受關(guān)注［6］。在植物中，藍光會抑制莖節(jié)間和下胚軸的伸長，對光形態(tài)建成和開花調(diào)控具有顯著的影響［7-8］。為了更好地理解這一現(xiàn)象，學(xué)者們對隱花色素的組成進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)主要由CRY1、CRY2和CRY3三大成員組成，其中，CRY1是參與藍光調(diào)控光形態(tài)發(fā)生過程的主要成分，而CRY2則與光周期調(diào)控開花時間有關(guān)，CRY3則主要負(fù)責(zé)損傷修復(fù)作用［9］。在真核微藻中，隱花色素也廣泛存在。例如，紅藻［9］、等鞭藻［10］和萊茵衣藻［11］等藻類都含有隱花色素。研究發(fā)現(xiàn)，在藍光條件下，萊茵衣藻中CRY蛋白的缺失會對類胡蘿卜素的合成以及光合系統(tǒng)的調(diào)控產(chǎn)生影響［12-13］，這一發(fā)現(xiàn)提供了更多關(guān)于隱花色素在微藻中的功能和作用機制的線索。

CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）在植物學(xué)領(lǐng)域中具有舉足輕重的地位，它是第一個被克隆的光形態(tài)建成核心調(diào)控因子［14-15］。光受體通過感知不同的波長，將外界信號傳遞給COP1，COP1再調(diào)控下游相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達［16］。在藍光條件下，COP1的功能受到一定的抑制，這種抑制作用有助于穩(wěn)定CO，進一步促進植物的開花過程［17-22］。值得注意的是，COP1會與CRY1直接相互作用，共同調(diào)控植物的光形態(tài)建成，這一互作關(guān)系提供了更多關(guān)于光響應(yīng)機制的深入理解。

為了進一步研究球等鞭金藻在光響應(yīng)過程中的機制，本研究利用酵母雙雜驗證藍光受體蛋白IgCRY1與IgCOP1蛋白之間是否相互互作，同時結(jié)合生物信息學(xué)分析IgCOP1蛋白的相關(guān)信息，進一步全面地了解COP1在藻類中的功能和作用機制，從而為藻類的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

球等鞭金藻Isochrysisgalbana來自福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，高保真限制酶、EcoR I和BamH I、質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒均購買自北京全式金生物公司，AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞及所贈送的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購買于上海唯地生物公司，pGADT7（AD）載體和pGBKT7（BD）載體由本實驗室保存。目的條帶所擴增的引物合成及菌落PCR驗證測序由擎科生物公司完成。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 球等鞭金藻總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄? 用北京全式金RNA提取試劑盒（Q20629）提取生長至藻細(xì)胞數(shù)約為1×108個的球等鞭金藻總RNA，參照說明書。對于球等鞭金藻總RNA的反轉(zhuǎn)錄參照北京全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Q20415）。

1.2.2? BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體的構(gòu)建? 利用北京全式金生物公司的同源重組試劑盒（CU201-03），設(shè)計在帶有酶切位點EcoR I和BamH I的pGBKT7載體同源臂引物，見表1，以球等鞭金藻的cDNA擴增目的片段，按說明書將克隆好的IgCRY1基因序列無縫克隆到pGBKT7載體上，IgCOP1基因序列無縫克隆到pGADT7載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，分別用卡那霉素（100 mg·mL-1）和氨芐卡那霉素（100 mg·mL-1）的LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR驗證，驗證正確的克隆進行送公司測序比對。

1.2.3? BD-IgCRY1載體自激活和毒性檢測? 將測序正確的 BD-IgCRY1質(zhì)粒和空載BD質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至AH109酵母感受態(tài)中。通過比較長在色氨酸缺陷型平板上的菌落情況來判斷BD-IgCRY1是否對 AH109 有細(xì)胞毒性作用，其中以含有空載BD 的菌為對照。并將含有BD-IgCRY1的酵母菌分別涂布于色氨酸缺陷、色氨酸缺陷加X-α-Gal以及色氨酸缺陷加X-α-Gal和AbA的平板上。觀察菌落是否變藍，來判斷BD-IgCRY1是否存在自激活現(xiàn)象。其中X-α-Gal的濃度為20 mg·mL-1，AbA的濃度為500 μg·mL-1。

1.2.4? 酵母雙雜驗證IgCRY1和IgCOP1的互作? 將測序正確的BD-IgCRY1和AD-IgCOP1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，涂布SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將AD空載和BD空載共轉(zhuǎn)以及BD-IgCRY1與AD空載共轉(zhuǎn)的酵母菌株作為陰性對照。

1.2.5? 生物信息學(xué)分析? 利用從擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp） 得到已知COP1蛋白序列，在球等鞭金藻的基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast P比對搜索篩選候選蛋白質(zhì)。球等鞭金藻COP1蛋白質(zhì)的分子量和等電點通過ExPASy（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）進行預(yù)測。應(yīng)用SWISS-MODEl（https：//swissmodel.expasy.org/）在線網(wǎng)站及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）網(wǎng)站預(yù)測IgCOP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域，并用Hydrophobicity ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/pscale/Hphob.Sweet.html）在線網(wǎng)站預(yù)測IgCOP1蛋白質(zhì)的疏水性，最后使用 MEGA7.0 軟件對球等鞭金藻和其他物種的蛋白質(zhì)序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 球等鞭金藻總RNA的提取? 本試驗提取生長至對數(shù)期的球等鞭金藻總RNA。用2%瓊脂糖電泳檢測，有3條完整的條帶（圖1）。用核酸蛋白儀檢測其濃度為560

ng·μL-1，純度OD260/OD280的比值為2.0。

2.2? BD-IgCRY1和AD-IgCOP1基因全長的克隆

以球等鞭金藻cDNA為模板，擴增IgCRY1和IgCOP1基因全長，其中IgCRY1為1560 bp，IgCOP1為1185 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行跑膠檢測，見圖2。

2.3? 誘餌蛋白BD-IgCRY1細(xì)胞毒性檢測

含BD-IgCRY1的酵母菌是否對AH109酵母細(xì)胞有毒性，結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比并無差別，因此BD-IgCRY1對酵母AH109無毒性。

2.4? 誘餌蛋白BD-IgCRY1自激活檢測

含有BD-IgCRY1的酵母菌AH109分別涂布于色氨酸缺陷、色氨酸缺陷加X-α-Gal以及色氨酸缺陷加X-α-Gal和AbA的平板上，由圖4可知，酵母菌在組氨酸缺陷加X-α-Gal平板能夠生長并且呈藍色，說明 BD-IgCRY1存在自激活現(xiàn)象。加上500 μg·mL-1的AbA發(fā)現(xiàn)BD-IgCRY1能正常生長且沒有變藍，說明該濃度下能夠抑制BD-IgCRY1的自激活現(xiàn)象。

2.5? 球等鞭金藻IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白的互作驗證

由圖5可知，AD-IgCOP1與BD-IgCRY1共轉(zhuǎn)化的菌株、AD空載與BD-IgCRY1載體共轉(zhuǎn)和AD與BD空載共轉(zhuǎn)在色氨酸、亮氨酸缺陷型的平板上均能正常生長，說明都成功共同轉(zhuǎn)入酵母菌株中。其中AD-IgCOP1與BD-IgCRY1共轉(zhuǎn)化的菌株在組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷型平板上也能正常生長，并且能使組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷型平板加X-α-Gal和AbA的培養(yǎng)基變藍（圖6）。但BD- IgCRY1與AD空載體、AD與BD空載共轉(zhuǎn)的菌在組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷性平板以及加X-α-Gal和AbA的平板上均無法生長。說明了 IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白可以發(fā)生相互互作。

2.6? 球等鞭金藻IgCOP1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.6.1? IgCOP1蛋白一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)的分析? 通過ExPaSy在線網(wǎng)站對IgCOP1進行一級結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果顯示，該蛋白的分子量大小為43.7 kDa，編碼的氨基酸個數(shù)為394個，等電點為4.77，為酸性蛋白。IgCOP1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為44.09，略大于40時，為不穩(wěn)定蛋白［11］。

為了進一步研究IgCOP1蛋白，其二級結(jié)構(gòu)見表2，不規(guī)則卷曲是IgCOP1的主要組成部分，占比為62.69%，而α-螺旋為7.61%，延伸鏈結(jié)構(gòu)為29.7%，無β-螺旋結(jié)構(gòu)（圖7）。

2.6.2? IgCOP1三級結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析? 對IgCOP1進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測建模見圖8。對IgCOP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析應(yīng)用SMART在線網(wǎng)站，由圖8可知，IgCOP1蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域為第80～370位是WD40結(jié)構(gòu)域。

2.6.3? 疏水性分析? 利用Hydrophobicity ProtScale軟件預(yù)測IgCOP1蛋白質(zhì)的疏水性。由圖10可知，IgCOP1蛋白質(zhì)疏水性最小為-3.179，最大值為1.367，并通過ProtParam軟件IgCOP1蛋白進行親疏水性分析，分析結(jié)果顯示其親水性平均系數(shù)為-0.544，是典型的親水蛋白。

2.6.4? IgCOP1系統(tǒng)發(fā)育樹分析? 通過NCBI下載不同物種中與IgCOP1同源性較高的氨基酸序列并進行多序列比對，與擬南芥、歐洲油菜、銀杏、蕓薹、豌豆、花生、水稻、大葉藻、布氏輪藻、蔭平鲉、條紋斑竹鯊的COP1蛋白序列進行建樹，由圖11可知，根據(jù)系統(tǒng)進化樹的分支情況，得到球等鞭金藻的COP1蛋白處于單獨一個分支。說明球等鞭金藻的COP1蛋白與其他物種發(fā)揮不同的功能。

3? 討論與結(jié)論

隱花色素作為一類藍紫光受體，在植物和藻類中參與了多種生理過程，并對環(huán)境刺激做出適應(yīng)性反應(yīng)。有研究表明，藍光能夠促進球等鞭金藻巖藻黃素和DHA含量的積累［23-24］。此外，藍光對其他藻類的生理特性也有著重要的影響。例如，在三角褐指藻中，短時間的藍光刺激培養(yǎng)同樣會增加巖藻黃素和不飽和脂肪酸物質(zhì)的積累［25］；在壇紫菜中，藍光能促進果孢子和殼孢子的萌發(fā)體顏色加深轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色［26］。這些研究揭示了藍光在調(diào)節(jié)藻類生長和發(fā)育中的重要作用。

為了深入研究球等鞭金藻在光下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，本研究首先從該藻中成功克隆了1560 bp和1185 bp的CDS片段，構(gòu)建了BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體，通過酵母雙雜驗證了IgCRY1與IgCOP1之間存在顯著的互作關(guān)系，生物信息學(xué)分析IgCOP1蛋白編碼394個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)為62.69%的不規(guī)則卷曲，是典型的親水蛋白。球等鞭金藻中IgCOP1蛋白與其他物種的COP1蛋白在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異。在模式植物擬南芥中，COP1蛋白包含了WD-40、RING finger和Coiled-coil3個結(jié)構(gòu)域［27］。而本研究發(fā)現(xiàn)，球等鞭金藻的COP1蛋白僅包含WD40結(jié)構(gòu)域，因此系統(tǒng)發(fā)育樹分析得到COP1與其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這表明該蛋白在演化過程中可能發(fā)生了一些適應(yīng)性的變化。

綜上所述，本研究不僅揭示了球等鞭金藻中CRY1和COP1蛋白之間的相互作用關(guān)系，并對IgCOP1蛋白進行理性分析。為了解CRY1和COP1在藻類中的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供理論基礎(chǔ)，并為未來的應(yīng)用研究提供有價值的參考。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）