基于兩步頂空進樣-GC-MS法分析不同類型煙葉的揮發性成分

周 妍，李俊杰，吳圣超，戚大偉，費 婷，吳 達，劉百戰

上海煙草集團有限責任公司技術中心，上海市浦東新區秀浦路3733 號 201315

煙葉中的揮發性成分是煙草香氣品質形成的主要來源之一，揮發性成分組成對煙草制品的風格品質具有重要影響，是衡量煙葉內在質量的重要依據［1］。煙葉類型包括烤煙、香料煙、白肋煙、晾曬煙和雪茄煙等。受煙葉品種和生態環境影響，不同類型煙葉的內在質量和化學成分存在很大差異。迄今國內針對煙葉揮發性成分的研究主要集中在烤煙、白肋煙和香料煙等［2-9］，雪茄煙葉較少涉及，對不同類型煙葉揮發性成分的系統研究和比較也相對較少。因此，系統剖析包括雪茄煙煙葉在內的不同類型煙葉揮發性成分組成和質量分數的差異，有助于深化不同類型煙葉感官品質形成機理研究，并可為煙葉的品質評價、風格剖析以及煙草制品的工業配方設計提供依據。

煙草中揮發性化合物種類多樣、成分復雜，某些重要成分質量分數很低，選擇合適的前處理和分析檢測方法十分重要。GC-MS法廣泛用于復雜樣品中揮發性成分的分離、鑒定和定量檢測，是煙草中揮發性物質的常用分析方法［10-12］。揮發性成分常見的提取方法有同時蒸餾萃取［13-14］、超臨界流體萃取［15-16］、頂空固相微萃取［5，9］、吹掃捕集［17］和靜態頂空［11-12］等。其中，同時蒸餾萃取法比較耗時，且易造成低沸點揮發性成分的損失；超臨界流體萃取法需要高壓設備，成本較高，不易推廣使用。頂空固相微萃取是目前分析煙草揮發性成分的主要方法，但其萃取效能受萃取頭極性、樣品頂空平衡溫度的影響很大。文獻［18］報道，較高的平衡溫度有助于提高固相微萃取方法的靈敏度，但會降低萃取頭對揮發性較強成分的吸附能力，如C5～C9的醛酮類化合物。吹掃捕集法靈敏度高，但穩定性稍差。相比之下，靜態頂空法操作簡便、穩定性好，是定量分析揮發性成分最常見的方法，但傳統靜態頂空受進樣體積限制，方法靈敏度較低。因此，本研究中將傳統靜態頂空（Headspace，HS）進樣器與程序升溫進樣口（Programmed temperature vaporizer，PTV）相結合，采用自制頂空進樣環（約30 mL）增大進樣體積，并采用PTV以避免進樣體積大導致的色譜峰展寬。靜態頂空進樣時，PTV處于溶劑排空模式，揮發性成分吸附于襯管內的Tenax-TA材料上；進樣完成后，被吸附劑捕集的揮發性成分在不分流模式下轉移至色譜柱，方法的靈敏度高。以烤煙、雪茄煙、白肋煙、香料煙和曬黃煙5種不同類型煙葉為研究對象，運用化學計量學方法比較了不同類型煙葉中揮發性化合物組成的差異。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙煙葉樣品8個、雪茄煙煙葉樣品11個、白肋煙煙葉樣品6 個、香料煙煙葉樣品6 個、曬黃煙煙葉樣品4 個（上海煙草集團有限責任公司提供），樣品產地、等級信息詳見表1。

表1 煙葉樣品信息Tab.1 Information of the tobacco samples

氘代苯乙烯（≥98%，加拿大TRC 公司）；C7～C30正構烷烴系列標品（美國Sigma-Aldrich公司）。

7890B/5975 GC-MS聯用儀，G7697自動頂空進樣器（美國Agilent 公司）；CIS-4 PTV 進樣口（德國Gerstel公司）；XPR204電子分析天平（感量0.000 1 g，美國Metler Toledo公司）；A11研磨機（德國Ika公司）；篩網（孔徑0.178 mm，紹興上虞圣超儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

煙葉樣品在40 ℃下烘10 h，磨粉后過孔徑0.178 mm 篩網。稱取0.5 g 煙末于20 mL 頂空瓶中，加入100 μL 內標溶液（5 μg/mL 氘代苯乙烯甲醇溶液），加蓋后進行兩步頂空進樣-GC-MS分析。每個樣品同時平行檢測3次。分析條件：

（1）靜態頂空條件

頂空爐箱溫度：90 ℃；進樣環溫度：120 ℃；進樣環體積：30 mL；傳輸線溫度：200 ℃；頂空瓶平衡時間：30 min；頂空瓶加壓壓力：206.84 kPa；頂空瓶加壓時間：0.2 min；頂空進樣環放空壓力：34.47 kPa；頂空進樣環填充時間：0.1 min；進樣環平衡時間：0.1 min；進樣時間：5 min。

（2）氣相色譜條件

程序升溫進樣口：填有Tenxa-TA填料的PTV襯管；進樣口升溫程序溶劑排空模式：排空流速40 mL/min，排空壓力320.68 kPa，保持至5.1 min；7.2 min 打開排空，流速100 mL/min；16 min時排空流速降至20 mL/min。

色譜柱：DB-WAX 毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（≥99.999%）；恒流模式流速：2.0 mL/min；升溫程序（15 min）。

（3）質譜條件

離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：240 ℃；質量全掃描范圍：35～450 amu。

1.2.2 揮發性化合物的鑒定

利用質譜庫匹配對揮發性化合物進行鑒定，對于NIST質譜庫匹配度大于85%的化合物，計算其實驗保留指數，并與NIST質譜庫提供的參考保留指數進行比對。使用C7～C30系列正構烷烴根據公式（1）計算實驗保留指數：

式中，tx為目標化合物x的保留時間，min；tn和tn+1分別是在化合物x 之前和之后洗脫的正構烷烴的保留時間，min。

1.2.3 數據分析

揮發性成分峰面積積分所采用的定量離子如表2 所示。揮發性成分與內標的峰面積比經對數變換和單位方差（Unit variance，UV）標度化處理后，采用ChemPattern 軟件（北京科邁恩公司）進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）。

表2 （續）

表2 （續）

表2 （續）

表2 35個煙葉樣品中鑒定出的揮發性化合物Tab.2 Volatile compounds identified in 35 tobacco samples

2 結果與討論

2.1 分析方法優化

比較了新的大體積進樣方法（進樣體積30 mL）與傳統頂空進樣方法（進樣體積1 mL）靈敏度的差異，結果如圖1所示。可見，新方法的靈敏度較傳統方法顯著提高，且色譜峰形良好。

圖1 不同進樣體積對應的色譜圖Fig.1 Chromatograms from different injection volumes

以5 種不同類型的煙葉粉末樣品充分混合后得到的質控樣品（Quality controlling，QC）作為考察對象，對方法參數進行優化。研究考察了不同樣品質量（0.05、0.10、0.25、0.50 g）對揮發性化合物檢出數量及檢測穩定性的影響，分別平行檢測5次，統計準確定性的化合物數量及峰面積RSD值≤25%的化合物數量，結果如圖2所示。可見，隨著樣品質量增加，檢出化合物數量及穩定檢出的化合物數量均逐步增加，當樣品質量分別為0.25 和0.50 g 時，檢出化合物數量已基本相當。當樣品質量為0.50 g 時，約97%的檢出化合物的穩定性均滿足差異分析要求。考慮到進一步增加樣品質量會導致煙堿嚴重殘留，最終確定選擇樣品質量0.50 g。

圖2 樣品質量對檢出化合物數量和檢測穩定性的影響Fig.2 Effects of sample mass on the numbers of detected volatile compounds and the analysis stability

此外，對樣品平衡溫度、平衡時間及PTV 排空流速等影響方法靈敏度及穩定性的關鍵參數進行了優化，結果如圖3所示。可見，升高平衡溫度有助于提升化合物響應強度；平衡時間達到30 min 后化合物的響應強度不再明顯提高；增大PTV 排空流速對化合物峰面積的影響呈先升高后降低的趨勢，過大的排空流速會造成揮發性成分損失。因此，最終確定方法參數為平衡溫度90 ℃、平衡時間30 min、排空流速40 mL/min。

圖3 樣品平衡溫度（a）、平衡時間（b）、PTV排空流速（c）對化合物峰面積的影響Fig.3 Effects of incubation temperature（a），incubation time（b）and PTV vent flow rate（c）on the peak areas of compounds

2.2 揮發性成分的鑒定及方法穩定性評價

共從QC 樣品中鑒定出除烴類化合物外的115種揮發性成分，還從烤煙中檢出（E，E）-3,5-辛二烯-2-酮、反-2-己烯醛，從雪茄煙中檢出異辛酸、1,2,3-三甲氧基苯，從香料煙中檢出二氫-γ-紫羅蘭酮，及在烤煙、白肋煙和香料煙中檢出巴豆酸，共計121 種揮發性化合物。按照化合物的代謝途徑及化學性質可分為脂肪酸降解產物16 種、酯類14 種、有機酸類11 種、焦糖化反應產物14 種、美拉德反應產物15 種、苯丙氨酸降解產物8 種、類胡蘿卜素降解產物21 種、萜烯類化合物8 種、煙堿相關化合物6 種，及其他化合物8 種，詳細信息見表2。可見，除9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、異瑟模環烯醇及麥司明外，其他化合物檢測結果的相對標準偏差均小于25%，說明兩步頂空進樣-GC-MS 法穩定性良好。

2.3 化學計量學分析

不同類型煙葉中揮發性化合物的類別相似，但其質量分數差異很大，很難直接明確不同類型煙葉與其揮發性成分之間的關系。因此，將峰面積RSD值≤25%的112 種揮發性化合物的相對峰面積值作為變量，數據經預處理后進行PCA 分析和HCA 分析，考察煙葉類型與揮發性成分間的關系。

不同類型煙葉樣品，經過主成分分析的系統降維后，選擇第一主成分、第二主成分和第三主成分做PCA 投影（圖4a）。第一主成分、第二主成分和第三主成分的方差貢獻率分別為22.30%、16.42%和12.90%，3個主成分的累計方差貢獻率為51.62%，說明PCA 分析結果比較理想。雪茄煙、白肋煙、烤煙、香料煙和曬黃煙區分清晰，表明不同類型煙葉的揮發性成分存在規律性差異。

采用平均距離法，以歐氏距離為測度，對不同類型煙葉樣品進行HCA分析（圖4b）。可見，36種煙葉樣品可以分成兩大類：第一大類包括香料煙、曬黃煙、白肋煙及烤煙，這4種類型煙葉的揮發性成分組成更為相似。在第一大類中，香料煙、曬黃煙與白肋煙又可聚為一小類，說明香料煙、曬黃煙及白肋煙的揮發性成分組成與烤煙差異稍大；香料煙與曬黃煙可聚為更小的一類，說明香料煙與曬黃煙的揮發性成分組成相似度最高。第二大類為雪茄煙，雪茄煙單獨良好聚類，表明雪茄煙的揮發性成分組成與其他4種類型煙葉有較大的差異。HCA分析結果說明通過揮發性成分分析可較好地區分不同類型煙葉。值得注意的是，HCA 分析中所有平行檢測樣品均良好聚類，再次說明兩步頂空進樣-GC-MS法的穩定性良好。

圖4 多元統計分析結果Fig.4 Results from multivariate statistical analysis

此外，對3 個不同產地的雪茄煙煙葉揮發性成分組成也進行了簡單分析，主成分分析的投影圖如圖4c 所示。可見，能較好區分不同產地的雪茄煙煙葉，說明不同產地雪茄煙煙葉的揮發成分組成具有規律性的差異。

2.4 不同類型煙葉揮發性成分分析

不同類型煙葉（35個煙葉樣品）中的112種揮發性化合物的熱圖如圖5 所示。結果表明，揮發性成分的質量分數在不同類型煙葉中的差別很大，但分布有一定規律：①脂肪酸降解產物。烤煙、曬黃煙、香料煙中質量分數整體較高，白肋煙和雪茄煙中較低。②酯類化合物。曬黃煙和香料煙中質量分數最高，白肋煙中次之，烤煙和雪茄煙中整體較低。③有機酸類化合物。香料煙和白肋煙中質量分數最高，曬黃煙和烤煙次之，雪茄煙中最少。④焦糖化反應產物。烤煙、香料煙和曬黃煙中質量分數整體較高，白肋煙與雪茄煙中最低。⑤美拉德反應產物。白肋煙、雪茄煙、香料煙和曬黃煙中質量分數均較高，但不同雪茄煙間差異較大，而烤煙中較低。⑥苯丙氨酸降解產物。白肋煙和香料煙中質量分數最高，曬黃煙次之，雪茄煙和烤煙中相近。⑦類胡蘿卜素降解產物。香料煙質量分數最高、曬黃煙和白肋煙中次之，不同產地雪茄煙間差異較大。⑧萜烯類化合物。白肋煙和香料煙中較高，曬黃煙、烤煙和雪茄煙中較低。⑨煙堿類化合物。白肋煙和雪茄煙中最高，曬黃煙次之，烤煙和香料煙中較低。

圖5 35個煙葉樣品揮發性成分的熱圖Fig.5 Heatmap of the volatile components from 35 tobacco samples

從煙葉類型看，烤煙中脂肪酸降解產物、焦糖化反應產物相較其他類型煙葉較高；曬黃煙和香料煙的揮發性成分組成高度相似，兩類煙葉中各類成分的質量分數均較高，但二者中煙堿相關化合物的差異顯著，香料煙中質量分數最低；白肋煙和雪茄煙的揮發性成分組成中美拉德反應產物及煙堿相關化合物的質量分數較高，但白肋煙中有機酸類及苯丙氨酸降解產物也較高；雪茄煙中大部分類別揮發性成分的質量分數均較低，如脂肪酸降解產物、焦糖化反應產物以及酯類和有機酸類化合物等，但美拉德反應產物和煙堿相關化合物的質量分數均處于較高水平，這是雪茄煙揮發性成分組成的顯著特點，可能與雪茄煙煙葉中含氮量非常高有關。其他類成分中的1,2,3-三甲氧基苯（已被確認為普洱茶霉味來源的關鍵成分，是普洱茶發酵過程中的微生物代謝產物［19］）在雪茄煙中的質量分數較高，其來源可能與雪茄煙的發酵工藝有關。

3 結論

①相較傳統方法，兩步頂空進樣-GC-MS 法具有較高靈敏度，方法穩定性也可滿足煙葉揮發性成分組成分析需求，共檢出121種揮發性成分；②煙葉揮發性成分組成與煙葉類型關系密切，曬黃煙與香料煙揮發性成分組成最為相似，雪茄煙的組成區別于其他類型煙葉，具有顯著自身特點；③雪茄煙中大部分揮發性成分的質量分數均較低，但美拉德反應產物及煙堿相關化合物的質量分數處于較高水平，這是雪茄煙揮發性成分組成的顯著特點，可能與雪茄煙煙葉中含氮量非常高有關；④雪茄煙煙葉揮發性成分組成與其產地有明顯關系。綜上所述，兩步頂空進樣-GC-MS 法簡便、可靠、靈敏度高，可作為今后煙葉質量評價、品質控制和風格特征剖析的重要手段。