普通煙草NtNDPK4基因的克隆與表達分析

李澤鋒，張佩佩，翟 妞，徐國云，鄭慶霞，劉萍萍，周會娜，張 慧

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一類廣泛存在于各種生物體內的高度保守的核苷酸代謝重要蛋白［1］。主要通過催化介導磷酸基團轉移，維持三磷酸核苷（Nucleoside triphosphate，NTP）和 三 磷 酸 腺 苷（Adenosine triphosphate，ATP）濃度平衡，因而與生物合成代謝、非生物脅迫、感病應激、光合作用和生物體能量代謝等息息相關［2］。長期以來，NDPK 蛋白的研究主要集中在哺乳動物，植物NDPK 蛋白的研究起步較晚。最早人們從豌豆中分離獲得第一個植物NDPK蛋白［3］，隨后又陸續從擬南芥、水稻、菠菜、番茄和白菜等植物中分離鑒定出多個NDPK蛋白［4-8］。目前植物NDPK 共有4 種類型，即為NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ。除NDPKⅣ功能尚不明確外，其余3類NDPK蛋白都具有多種生物學功能［2］。

NDPKⅡ主要參與活性氧清除、生長素調節和植物光合作用。擬南芥中AtNDPK2 能夠與MAPK 相互作用清除活性氧，同時在葉綠體功能和生長素信號轉導中都發揮重要作用［9］。擬南芥Atndpk2突變體在紅光和遠紅光下都表現出子葉不能張開和變綠的缺陷，即該基因參與了葉片的光形態建成［10］。在水稻中發現NDPK2可以調控其他相關基因的轉錄水平進而影響葉綠體發育和葉綠素的生物合成［11-12］。將擬南芥AtNDPK2 在毛果楊中過量表達后植株的抗鹽、抗旱能力顯著增強，且轉基因植株中生長素相關的吲哚乙酸基因表達量顯著升高［13-14］。同樣苜蓿中過表達AtNDPK2基因后在不同非生物脅迫條件下均可提高苜蓿的生物量和產量［15］。近年來，植物核苷二磷酸激酶受到廣泛關注［16-18］。煙草是我國一種重要的經濟作物，研究表明非生物脅迫對其生長發育及品質影響較大［19-20］。本研究中在普通煙草K326中克隆、鑒定了NtNDPK4基因，利用生物信息學的方法對NtNDPK4 蛋白的理化性質、亞細胞定位、磷酸化位點、進化關系及順式作用元件等進行了系統分析，同時利用qPCR方法檢測了NtNDPK4基因的組織表達特異性及激素和光照處理響應中的表達模式，旨在為進一步探明煙草NtNDPK4基因的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

普通煙草K326 于2021 年種植在國家煙草基因研究中心的人工氣候室，采集盛花期煙株的根、莖、葉（中部葉）和花（花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊）等組織器官，經液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存備用。

激素處理和光照處理的K326 煙苗種植于光照培養箱，培養條件：溫度（26±1）℃，相對濕度60%±2%，16 h光照培養，8 h黑暗培養。

激素處理方法：K326 種子經75%酒精消毒1～2 min 后用10% NaClO 消毒10 min，用滅菌水反復沖洗3～5次，在1/2 MS固體培養基上播種。幼苗長出4 片真葉后移栽至1/2 Hoagland 營養液中，待6 片真葉長出后選取長勢均勻的幼苗進行外源激素處理，即在Hoagland營養液中分別加入各種激素。處理激素有茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、獨角金內酯類似物（GR-24）、生長素（IAA）、水楊酸（SA）、赤霉素（GA）和細胞分裂素（6-BA）。其中，MeJA的濃度是100 μmol/L，其余激素濃度是10 μmol/L。處理6 h后取樣，每個處理設置3次生物學重復，每個重復選取3株幼苗，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存備用。

光照處理方法：種子消毒和播種方法同上。播種后，留下對照平板正常光照下培養（簡稱光照），其余平板用錫箔紙包裹避光后在同樣環境下培養。5 d后，將避光培養的平板去除錫箔紙放于光照下正常培養（留取一直避光的樣品作為黑暗對照，簡稱黑暗），于恢復光照后2、6、12、24和48 h分別取樣，48 h時對光照和黑暗樣品也進行取樣，每個處理取3個平板，每個平板取大小一致的煙草幼苗10株，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草總RNA提取及cDNA合成

采集幼苗期的煙草葉片，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取煙草總RNA，測定濃度后，根據羅氏第一鏈cDNA 合成試劑盒（Transcriptor first strand cDNA synthesis Kit）說明書對其進行反轉錄，獲得cDNA。

1.2.2 煙草NtNDPK4基因克隆

從中國煙草基因組數據庫4.0 網站上獲取NtNDPK4基因的CDS序列，用Primer Premier 5設計PCR擴增引物（上游引物NtNDPK4_F：5'- TGGGCAT CGATACGGGATCCATGGAGGGTCTTACCAT -3'，下游引物NtNDPK4_R：5'- TTCATCTGCAGCTCGA GCTCTTATTCCATCAACCAAGG -3'）。以煙草葉片的cDNA為模板進行擴增，PCR反應總體系50 μL：

5×PrimeSTAR GXL buffer 10 μL，dNTP Mixture 6 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 補至50 μL。PCR 反應程序：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，30個循環。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA 純化試劑盒［寶日醫生物技術（北京）有限公司］對目的片段進行回收，回收得到的產物用In-Fusion試劑盒［寶日醫生物技術（北京）有限公司］連接至pGAD載體并轉化DH5α大腸桿菌感受態（北京全式金生物有限公司），37 ℃培養過夜。陽性克隆經測序正確后提取陽性克隆質粒。

1.2.3 生物信息學分析

使 用NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）對序列ORF 進行查找，之后使用EMBOSS Transeq（http：//embossgui.sourceforge.net/demo/transeq.html）將其翻譯為氨基酸序列；使用ProtParam（ExPASy-ProtParam tool）對蛋白理化性質進行預測；分別采用TMHMM 2.0［21］（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 6.0［22］（SignalP-6.0-Services-DTU Health Tech）對蛋白跨膜結構域、信號肽進行預測；運用DeepLoc-1.0［23］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepLoc-1.0）進行亞細胞定位預測；使用NetPhos［24］（NetPhos-3.1-Services-DTU Health Tech）對蛋白磷酸化位點進行預測；通過SOPMA［25］（NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction（ibcp.fr））進行蛋白二級結構預測；基于在線工具PlantCARE［26］（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子區域（上游2 Kb）順式作用元件進行搜索；同源序列使用MUSCLE［27］（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）進行聯配，利用MEGA 7.0［28］構建系統進化樹。

1.2.4 煙草NtNDPK4基因表達定量分析

以煙草不同組織、不同激素處理及黑暗處理后恢復光照的樣品cDNA 為模板，用qPCR 的方法檢測煙草NtNDPK4 基因的表達量。設計NtNDPK4基因的qPCR 引物（上游引物RT-NtNDPK4_F：5'-CACCATAGACCTCCTATT-3'，下 游 引 物 RTNtNDPK4_R：5'-TCCATCAGGCTTAATCAT-3'），使用Roche LightCycler 96 實時熒光定量PCR 儀進行qPCR 實驗。內參基因選擇煙草的26S rRNA基 因［29］，該基因的qPCR 引物上游序列26S_F：5'- GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'，下 游 序 列26S_R：TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。反應總體系20 μL（10 μL 2 × SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 補至20 μL），反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45 個循環。每個樣品3 次重復。根據循環閾值（Ct值），用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 煙草NtNDPK4基因的克隆

以煙草K326 的幼苗葉片cDNA 為模板，PCR 擴增后的產物經瓊脂糖電泳檢測如圖1所示。測序表明該片段長678 bp，編碼225 個氨基酸，將其命名為NtNDPK4。

圖1 NtNDPK4基因的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of NtNDPK4 gene

2.2 煙草NtNDPK4蛋白生物信息分析

基于植物中已發表的NDPK 蛋白質序列，利用MEGA 7.0 構建系統進化樹。結果如圖2 所示，NtNDPK4屬于NDPKⅡ類型，與煙草NtNDPK2關系最近。進一步將NDPKⅡ類型蛋白序列進行聯配發現，NtNDPK4與其他NDPKⅡ相似性較高，在序列上較為保守（圖3）。

圖2 植物NDPK蛋白的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins in selected plants

圖3 不同植物NDPKⅡ蛋白序列比對Fig.3 Alignment of NDPKⅡprotein sequences in different plants

分析發現NtNDPK4 蛋白分子量大小24.95 kDa，等電點8.34，正電荷氨基酸殘基數（Arg+Lys）24個，負電荷氨基酸殘基數（Asp+Glu）22 個。該蛋白不存在跨膜區且無信號肽，屬于胞內蛋白。亞細胞定位預測NtNDPK4 定位于葉綠體基質的可能性最大。磷酸化位點預測發現：11個絲氨酸磷酸化位點，分別是S15、S21、S22、S25、S30、S54、S73、S99、S130、S193 和S195；4 個蘇氨酸磷酸化位點，分別是T19、T109、T176 和T185；3 個酪氨酸磷酸化位點，分別是Y81、Y125 和Y140。二級結構預測發現，NtNDPK4包含4 種結構形式，其中隨機卷曲88 個（占比39.11 %）、α螺旋79 個（占比35.11 %）、延伸鏈44 個（占比19.56 %）、β折疊14個（占比6.22 %）。

為進一步了解NtNDPK4 基因的功能，對NtNDPK4 基因順式作用元件進行了預測，結果如表1 所示，該基因啟動子區域含有激素響應相關元件，如 ABRE、TGACG-motif、P-box、CGTCA-motif、TCA-element和AuxRR-core等。同時也包含光響應相關元件，如G-box、Box 4、chs-CMA1a和AT1-motif等。另外還有一些其他元件，如生長發育相關元件circadian，逆境脅迫相關元件ARE、MBS、LTR 和GC-motif等。

表1 NtNDPK4啟動子順式作用元件統計Tab.1 Statistics for cis-acting elements of promoter of NtNDPK4

2.3 煙草NtNDPK4基因表達分析

為了檢測煙草NtNDPK4基因在不同組織中的表達情況，分別以根、莖、葉和花等組織的cDNA為模板，qPCR結果（圖4）表明，NtNDPK4基因在這些器官中都有表達，且根中的表達量顯著高于莖、葉和花等組織。在花的各個器官中，花瓣中NtNDPK4基因的表達量最高。

圖4 NtNDPK4基因在煙草不同組織中的表達量Fig.4 Expression levels of NtNDPK4 in different tissues of tobacco

為了檢測煙草NtNDPK4基因在不同激素處理下的表達情況，分別用MeJA、ABA、GR-24、IAA、SA、GA 和6-BA 等7 種激素對K326 幼苗進行處理采樣，qPCR 結果（圖5）表明，除SA 和GR-24 外，NtNDPK4基因在其他激素處理樣品中的表達量都顯著提高（P＜0.05），尤其是受到GA的顯著誘導（P＜0.01）。這表明NtNDPK4參與了激素應答響應。

圖5 NtNDPK4基因在不同激素處理煙草中的表達量Fig.5 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different hormone treatments

為了檢測煙草NtNDPK4 基因是否與光照有關，對煙草幼苗黑暗處理后恢復光照不同時間采集的樣品利用qPCR 技術檢測NtNDPK4 基因的表達量，結果如圖6 所示。在恢復光照12 h 時，該基因被顯著誘導（P＜0.05），24 h時該基因的表達量最高，說明該基因參與了光照響應。

圖6 NtNDPK4基因在不同光照處理的煙草中的表達量Fig.6 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different light treatments

3 討論

從普通煙草K326克隆獲得了1個煙草核苷二磷酸激酶基因NtNDPK4，該基因CDS 長度約678 bp，編碼225個氨基酸。進化分析表明NtNDPK4與擬南芥AtNDPK2 和煙草NtNDPK2 同屬NDPKⅡ型，這類NDPK 基因可能參與活性氧清除、生長素調節和植物光合作用等過程。亞細胞定位預測，NtNDPK4最有可能定位于葉綠體。順式作用元件分析結果推測，NtNDPK4 可能參與激素響應和光照響應。進化分析及序列比對發現，煙草中有兩個NDPKⅡ型基因，即NtNDPK2和NtNDPK4，兩個基因編碼的蛋白相似度約80%。NtNDPK2 可能參與活性氧的清除［30］，NtNDPK4 基因與NtNDPK2 基因是否有功能冗余，還有待進一步研究。

NtNDPK4 基因在煙草各個組織中都有表達，且根部表達相對較高。值得注意的是，該基因在花的各個器官中以花瓣中的表達最高，這一結果與中國白菜中的研究結果一致［8］。水稻［5］和楊樹［13］中NDPK2基因則是在幼嫩的葉片中表達量最高。NDPKⅡ基因組織表達的多樣性也預示著這些基因可能具有不同的功能。在擬南芥中，AtNDPK2 突變后下胚軸變短，生長素運輸增強［9］。本研究中除生長素外使用了多種激素處理煙草幼苗，發現NtNDPK4 基因的表達受到了顯著誘導，尤其是赤霉素處理后該基因的表達上調了近50 倍，但該基因在煙草GA 代謝中的重要作用仍有待進一步深入研究。與中國白菜BcNDK2 功能類似，NtNDPK4 的表達受到光照誘導，但該基因參與光照響應的具體機制有待深入探索。

4 結論

本研究中從栽培煙草K326 中克隆獲得NtNDPK4 基因，進化分析發現該基因屬于NDPKⅡ型。NtNDPK4基因在根、莖、葉和花中均有表達。在GA、IAA、6-BA、ABA 和MeJA 等 激 素 處 理 下，NtNDPK4 基因的表達量顯著提高。同時，黑暗生長的煙草幼苗恢復光照12 h 后，NtNDPK4 基因表達明顯上調。這表明該基因在煙草非生物脅迫中可能具有重要作用。