UPLC-MS/MS法測(cè)定維格列汀中4-二甲氨基吡啶

王玉如 劉曉敏 盧忠秋 蘭公劍

南京正大天晴制藥有限公司，江蘇南京 210046

維格列汀屬于高選擇的二肽基肽酶4抑制劑的口服降糖藥物，臨床用于2型糖尿病患者的治療，可有效調(diào)節(jié)血糖水平，改善胰島功能，降低糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，具有不良反應(yīng)少和安全性高等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。在維格列汀合成工藝中用到了4-二甲氨基吡啶，該雜質(zhì)含有警示結(jié)構(gòu)芳香雜環(huán)，屬于潛在遺傳毒性雜質(zhì)[4]。遺傳毒性雜質(zhì)在微量的水平下可誘導(dǎo)DNA發(fā)生突變，具有潛在致癌性，威脅人類的健康[4-7]，已被廣泛關(guān)注及嚴(yán)格控制。因此有必要建立一種維格列汀中4-二甲氨基吡啶的檢測(cè)方法。目前國內(nèi)外關(guān)于4-二甲氨基吡啶檢測(cè)的研究較少，對(duì)維格列汀中4-二甲氨基吡啶的測(cè)定尚未見報(bào)道[8-10]。根據(jù)歐洲EMA、美國FDA、國際藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）和《中華人民共和國藥典（四部）》關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則等要求[11-13]，遺傳毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾 值（threshold of toxicological concern，TTC）為1.5 μg/d。維格列汀制劑一般日最大使用劑量為100 mg，所以維格列汀中4-二甲氨基吡啶的限度為15 ppm，為從嚴(yán)控制，將限度定為11 ppm，限度較低，液相色譜方法達(dá)不到靈敏度要求。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高及結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)[14-16]，可以滿足痕量雜質(zhì)檢測(cè)的要求。本研究首次建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry，UPLC-MS/MS），可準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定維格列汀原料藥中基因毒性雜質(zhì)4-二甲氨基吡啶的殘留量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1290超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；6470三重四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；ME36S電子分析天平（賽多利斯-上海貿(mào)易有限公司）；MSU225P電子分析天平（賽多利斯-上海貿(mào)易有限公司）；XSE205DU 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

乙酸銨（LC/MS級(jí)別，上海安譜科技有限公司），乙酸（LC/MS級(jí)別，上海安譜科技有限公司），乙腈（HPLC級(jí)，默克股份有限公司）；4-二甲氨基吡啶對(duì)照品（批號(hào)：43594，純度：99%，阿拉丁-上海有限公司）；維格列汀原料藥（批號(hào)：157200501、157200502、157200503、105200401，南京正大天晴制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法條件

2.1.1 色譜條件 液相色譜柱Waters ACQUITY BEH HILIC（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流 動(dòng) 相：乙酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L乙酸銨溶液，乙酸調(diào)至pH 4.0）：乙腈（10∶90）；分析時(shí)間：8 min；流速0.3 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：1 μl。六通閥切換設(shè)置：2 min設(shè)置進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，正離子模式檢測(cè)；4-二甲氨基吡啶離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)見表1。離子源參數(shù)：干燥氣溫度300℃；干燥氣流速6 L/min；鞘氣溫度325℃；鞘氣流速11 L/min；霧化器壓力45 psi；噴嘴電壓500 V；毛細(xì)管電壓3500 V。

表1 4-二甲氨基吡啶離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 取4-二甲氨基吡啶對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，用溶劑[乙腈-水（90∶10）]溶解并定量稀釋制成每1 ml約含110 ng的溶液，作為對(duì)照品貯備液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取對(duì)照品貯備液適量，用溶劑[乙腈-水（90∶10）] 定量稀釋制成每1 ml約含5.50 ng的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取維格列汀約10 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，用溶劑[乙腈-水（90∶10）]溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取溶劑[乙腈-水（90∶10）]、對(duì)照品溶液和供試品溶液（批號(hào)：105200401）各1 μl，按照上述色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。溶劑和供試品溶液均不干擾4-二甲氨基吡啶的測(cè)定，表明本方法的專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)TIC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備液適量，分別用溶劑[乙腈-水（90∶10）]溶解并定量稀釋制成每1 ml約含0.55、2.75、4.40、5.50、8.25、11.00 ng（10%～200%限度濃度）的系列濃度的線性溶液，取各濃度的線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法條件進(jìn)樣，以4-二甲氨基吡啶的濃度為橫坐標(biāo)（x），以4-二甲氨基吡啶的峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸。回歸方程為：y=16909.6915x+3948.9297，r=0.9993。結(jié)果表明，4-二甲氨基吡啶在濃度0.55～10.98 ng/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限與檢測(cè)限試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備液適量，用溶劑[乙腈-水（90∶10）]逐步稀釋，分別稀釋至信噪比S/N≥10為定量限溶液；至信噪比S/N≥3為檢測(cè)限溶液。結(jié)果該方法下4-二甲氨基吡啶的定量限濃度為0.02 ng/ml（相當(dāng)于供試品濃度的百分比0.04 ppm）；平行測(cè)定6次峰面積RSD為4.18%（n=6）檢測(cè)限濃度為0.005 ng/ml（相當(dāng)于供試品濃度的百分比0.01 ppm），結(jié)果表明，定量限濃度明顯低于限度濃度（11 ppm），方法靈敏度較好，符合檢測(cè)要求。

2.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取維格列汀樣品（批號(hào)：105200401）10 mg，精密稱定9份，置20 ml量瓶中，用溶劑[乙腈-水（90∶10）]溶解，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各0.50、1.00、1.50 ml，分別用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為50%回收率溶液、100%回收率溶液和150%回收率溶液；每個(gè)濃度水平平行配制3份。按“2.1”項(xiàng)下方法條件檢測(cè)，結(jié)果表明，4-二甲氨基吡啶回收率在88.80%～92.60%，RSD為1.25%（n=9），表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.3.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為1.41%（n=6），表明該儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取維格列汀樣品（批號(hào)：105200401）10 mg，精密稱定6份，置20 ml量瓶中，用溶劑[乙腈-水（90∶10）]溶解，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.00 ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為重復(fù)性溶液。依法測(cè)定，結(jié)果4-二甲氨基吡啶含量的RSD為1.63%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn) 不同的分析人員在不同日期進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，照“2.3.6重復(fù)性”項(xiàng)下方法重新配制對(duì)照品溶液和6份加標(biāo)供試品溶液，測(cè)定加標(biāo)供試品溶液中雜質(zhì)的含量，與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算12次測(cè)量結(jié)果的RSD。結(jié)果4-二甲氨基吡啶含量的RSD為4.02%（n=12），表明該方法中間精密度良好。

2.3.8 溶液穩(wěn)定性 按照“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下溶液配制方法，分別配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，在室溫條件放置0、2、5、9、11、13、16、18、20 h后測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積與0 h比值均介于101.03%～111.98%，供試品溶液的雜質(zhì)檢出量與0 h極差為0.01 ppm，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液室溫放置20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測(cè)定

取4批 樣 品（批 號(hào)：157200501、157200502、157200503、105200401），按“2.2.3”項(xiàng)下溶液配制方法配制供試品溶液，按“2.1”方法條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計(jì)算，得到4-二甲氨基吡啶的檢出量分別為0.04、0.11、0.07、0.06 ppm。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用了不同流速（0.28、0.30、0.32 ml/min）、不同柱溫（25℃、30℃、35℃）及不同有機(jī)相比例（88%、90%、92%），結(jié)果表明，適當(dāng)微調(diào)系統(tǒng)參數(shù)，對(duì)4-二甲氨基吡啶的測(cè)定均無影響。本方法具有專屬性良好、線性范圍寬、準(zhǔn)確度良好和靈敏度高等特點(diǎn)，可用于維格列汀中4-二甲氨基吡啶的測(cè)定。