頭孢克肟片微生物限度檢查方法研究

楊 麗 賴燁才 伍雙茜 陳婉榕

廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣東廣州 510515

頭孢克肟（cefixime）為第三代頭孢菌素類抗生素，由日本藤澤制藥于20世紀80年代研發成功并應用于臨床，其對革蘭陰性菌有較強的抗菌活性，對多種革蘭陽性菌尤其是葡萄球菌抗菌活性較低[1-2]。頭孢克肟能與青霉素結合蛋白（PBP）相結合，抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成，從而破壞細菌分裂，起抗菌作用[3-4]。目前市場上頭孢克肟的劑型很多，但有關微生物限度檢查方法研究比較少，且已不適用于新版藥典要求，因此建立此類藥物合適的微生物限度檢查方法是有必要的。在探索頭孢克肟片微生物限度檢查方法適用性時，只有通過消除其抑菌活性而建立的方法，才能真實反映其微生物污染情況，防止出現假陰性結果，這對該產品生產放行、有效期存放和企業微生物控制體系建立[5]具有重大意義。本研究依照《中華人民共和國藥典》（縮寫為“ChP”）2020年版四部[6]進行方法適用性試驗，通過利用β-內酰胺酶（頭孢菌素酶）[7-8]與頭孢類藥物結合使其抗菌活性降低，結合薄膜過濾法、延長酶作用時間、不影響檢驗標準選擇更高稀釋級等方法，發揮協同作用而去除樣品的抑菌性，從而為頭孢克肟片的微生物限度檢查提供合理、有效和可行的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1600IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；EZ-FIT微生物過濾三聯支架（美國默克密理博）；BCE822-1CCN電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；BSP-250生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；IN812C低溫培養箱（廣州貝特生物科技有限公司）；XG1.DTED-0.6D脈動真空滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）。

1.2 樣品與培養基

頭孢克肟片（白云山制藥總廠，批號：02210201-1、02210801、02210802，規格：0.1 g）；頭孢菌素酶（≥210萬單位/5 ml，蘇州普今生物科技有限公司，批號：2103020）。

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）[默克化工技術（上海）有限公司]、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）[默克化工技術（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）[默克化工技術（上海）有限公司]、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）[默克化工技術（上海）有限公司]、麥康凱液體培養基（MacB）（廣東環凱微生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂培養基（MacA）（廣東環凱微生物科技有限公司）、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環凱微生物科技有限公司）、0.1%無菌蛋白胨水溶液（廣東環凱微生物科技有限公司），培養基適用性試驗均符合ChP 2020年版規定。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球 菌[CMCC（B）26003]、銅 綠 假 單 胞 菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

按ChP 2020年版四部制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌的102～104cfu/ml的菌懸液，進行活菌計數備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，放入預熱不超過45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖混勻，靜置5 min，取上層溶液[9]作為1∶10供試液，并用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋為1∶100的供試液。

2.3 微生物計數方法適用性試驗

2.3.1 需氧菌總數

2.3.1.1 方法適用性預試驗 方案Ⅰ：取1∶10供試液10 ml，分別加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/ml），將含菌供試液1 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液中經薄膜過濾后，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量分別為300、500、700 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅱ：取1∶100供試液10 ml，加入0.1 ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液混勻（≤100 cfu/10 ml），將含菌供試液10 ml加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液中經薄膜過濾后，用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液（100 ml/次），總量為500 ml沖洗，濾干后取出濾膜，貼于約含20 ml TSA（含頭孢菌素酶300萬單位/100 ml TSA）并凝固的平皿上。

方案Ⅰ和Ⅱ分別以同法測定菌液組和供試品對照組，分別計算回收比值。各平皿于32℃倒置培養3 d，逐日觀察。

結果顯示，采用方案Ⅰ和300、500、700 ml沖洗量，銅綠假單胞菌回收比值分別為0.33、0.41、0.43，枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.20、0.35、0.41，均＜0.5；采用方案Ⅱ和500 ml沖洗量，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值分別為0.81、0.92和0.93，均在藥典規定的0.5～2.0之間。見表1。

表1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌預試驗回收比值

2.3.1.2 方法適用性試驗 根據預試驗結果，方案Ⅱ是可行的，因此本試驗按照方案Ⅱ采用3批次樣品，以及ChP規定的5種需氧菌進行計數方法適用性試驗，并設菌液組、供試品對照組以及滅活劑對照組。根據預試驗結果，對ChP規定的5種需氧菌進行3批次的計數方法適用性試驗，結果顯示，試驗組和滅活劑對照組中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌回收比值均＞0.90，均在ChP規定的0.5～2.0之間，故可照該供試品制備方法和計數方法測定頭孢克肟片的需氧菌總數。見表2。

表2 需氧菌總數和滅活劑對照組回收比值

2.3.2 霉菌和酵母菌總數方法適用性試驗 頭孢克肟屬于β-內酰胺類抗生素，具有較強的抗細菌活性，但對真菌（霉菌和酵母菌）基本無抗菌活性[9-11]，所以采用平皿法對其進行檢查方法適用性試驗。取1∶10供試液1 ml按照ChP 2020年版1105要求對3個不同批次進行試驗。結果顯示，霉菌和酵母菌總數按照平皿法操作，3批次白色念珠菌回收比值均為0.92，黑曲霉菌回收比值分別為0.92、0.92和0.90，均在ChP規定的0.5～2.0之間，故此方法測定頭孢克肟片的霉菌和酵母菌總數有效、可行。見表3。

表3 霉菌和酵母菌總數回收比值

2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法適用性試驗

方案①：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為500 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案②：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（約100 ml/次），總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬單位的頭孢菌素酶，濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案③：取1∶10供試液10 ml，加至100 ml 45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液混勻，全量經濾膜過濾，再用45℃ 0.1%無菌蛋白胨水溶液適量（100 ml/次，總量為300 ml，在最后100 ml沖洗液中加入1 ml大腸埃希菌菌懸液（≤100 cfu/ml），并在最后20 ml沖洗液中加入酶活力不少于60萬單位的頭孢菌素酶，靜置10 min后濾干，取出濾膜接入不少于100 ml TSB（含頭孢菌素酶60萬單位/100 ml TSB）中。

方案①、②和③的試驗組均采用3個不同批次進行試驗，并分別設立陽性對照組和陰性對照組，培養物于32℃培養至規定時間。結果顯示，采用方案①和方案②，3批次試驗組中均有1批次未檢出大腸埃希菌，方案③中3批次均可檢出大腸埃希菌，故可用方案③控制菌檢查法進行頭孢克肟片的大腸埃希菌檢查。見表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

徐秋萍等[12]建立頭孢克肟顆粒的微生物限度檢查方法，需氧菌計數是供試液經薄膜過濾法后再加入試驗菌株，這種加菌方法已不適合現行ChP要求。本研究先接種試驗菌于供試液[13]，采用薄膜過濾法、滅活劑及作用時間、選用更高稀釋級聯合應用，消除或減弱頭孢克肟的抑菌作用，建立的方法可確保在檢查時能檢出樣品真實微生物含量。

通過薄膜過濾法可將供試品中抑菌成分有效去除，促進供試品污染微生物生長和繁殖。本研究采用薄膜過濾法減弱本品的抑菌活性，降低對各試驗菌的影響；試驗采用1∶10含菌供試液用薄膜過濾法，沖洗液量多至700 ml時，銅綠色假單胞菌和枯草芽孢桿菌回收比值仍低于0.5，可見頭孢克肟對這兩種菌株有較強的抑菌作用，表明1∶10供試液不適合用于需氧菌計數檢查。

加入適宜的滅活劑以及采用供試液的更高稀釋級進行需氧菌計數。滅活劑添加到沖洗液或培養基中能鈍化、中和供試品抑菌活性，進一步消除其抑菌成分；另外由于頭孢克肟片是口服制劑，在不影響結果判斷情況下，可采用使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數試驗。本研究需氧菌計數采用1∶100含菌供試液[14]經薄膜過濾法沖洗，并加頭孢克肟的滅活劑β-內酰胺酶[15]約60萬單位于平皿培養基中，各菌株回收比值均在0.5～2.0之間，符合ChP規定。

延長滅活劑作用時間[16]，頭孢菌素酶是一種蛋白質，分子直徑大約在1～100 nm之間，遠低于常用截留需氧菌的濾膜孔徑（0.45 μm），因此在大腸埃希菌檢查方法適用性試驗中，在最后20 ml沖洗液中加入頭孢菌素酶靜置10 min，便于酶與殘留于濾膜上的頭孢克肟充分反應，有效去除樣品的抑菌性，更有利于檢出大腸埃希菌。

藥物微生物限度檢查方法適用性試驗的目的，首先是要為藥物制劑尋求一個具有專屬性、有效性和可行性的檢查方法；其次是方法操作要簡單，檢查成本低、污染風險低，能滿足企業常規化的微生物檢驗。本研究通過采用多種方法相結合來建立頭孢克肟片微生物限度檢查方法，所建立的試驗方法操作方便，對不同廠家生產的頭孢克肟原料和制劑的微生物限度檢查方法具有一定的參考價值。