維生素D3對帕金森病小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

王孺賢 馮彩霞 劉雪齊 烏 蘭

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014030

帕金森病（parkinson disease，PD）的病理特征是選擇性黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）的異常聚集被認(rèn)為是PD致病的關(guān)鍵因素。α-syn包含體異常聚集引起黑質(zhì)紋狀體通路遭受破壞，殼核、尾狀核中多巴胺的含量降低，從而誘發(fā)一系列錐體外系癥狀[1-2]。維生素D3（vitamin D3，VD3）也稱膽鈣化醇，依次經(jīng)肝臟25-羥化酶、腎臟1 -羥化酶作用，最后生成1，25-二羥維生素D3[3-4]。維生素D屬于類固醇激素的一種，能與維生素D受體結(jié)合調(diào)節(jié)乙酰膽堿、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的合成[5-6]。針對中晚期PD患者的異動癥、癥狀波動及復(fù)方左旋多巴的療效減退，一直沒有有效的控制藥物，希望本研究能為臨床提供一定的思路。本研究旨在通過研究PD小鼠黑質(zhì)α-syn、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的變化，探討VD3對帕金森病模型小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只C57BL/6J雄性8～10周的小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，使用許可證：SCXK（京）2019-0010。在溫度20℃～24℃、濕度40%～70%的條件下普通飼料飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律。動物的治療和行為測試在光周期進(jìn)行。小鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后開始實驗。實驗過程遵循包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定（2020年科倫審第LW-009）。

1.2 主要試劑與儀器

VD3（索萊寶科技有限公司，批號：V8070， 規(guī)格：1000 mg，含量97%）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）（美國Sigma，批號：M0896，規(guī)格：100 mg）；抗體（英國abcam公司）；RNA提取試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；引物制備（生工生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 PD小鼠模型[7]建立及分組

50只小鼠隨機(jī)分為5組，模型組給予MPTP（20 mg/kg）腹腔注射，30 min后注射與VD3等體積的生理鹽水7 d，后每天腹腔注射等體積的生理鹽水14 d；低、中和高不同劑量VD3組給予MPTP（20 mg/kg）腹腔注射，30 min后分別腹腔注射VD3（0.5、1.0、2.0 μg/kg）7 d，后每天腹腔注射VD314 d；對照組腹腔注射與MPTP組等體積的生理鹽水，30 min后注射與VD3等體積的生理鹽水7 d，然后每天腹腔注射等體積的生理鹽水14 d。

1.4 第21天對小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試

1.4.1 爬桿試驗評價小鼠運動協(xié)調(diào)能力 采用直徑為1 cm，長度50 cm的木桿，直徑為2.5 cm的一個小球固定在木桿的頂部，木桿用紗布纏繞，將小鼠放于球頂，小鼠的兩只前上肢接觸桿底所在平臺時定義為爬完全程[8]，記錄小鼠在木桿頂部的停留時間和爬桿時間，測定3次，間隔時間1 h，取平均值。

1.4.2 滾軸實驗評價小鼠運動平衡能力 將預(yù)訓(xùn)練的小鼠置于轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速4～40 r/min，記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒開始旋轉(zhuǎn)到掉下轉(zhuǎn)棒的時間，測試時間5 min，測定3次，間隔時間1 h，取平均值。

1.5 RNA提取和實時熒光定量PCR（qPCR）

小鼠黑質(zhì)總RNA濃度測定采用Trizol試劑和異丙醇沉淀法分離。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按總RNA 1 μg為模板將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參引物，結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算α-syn、TH的mRNA的相對表達(dá)水平。引物見表1。

表1 引物序列

1.6 Western Blot檢測黑質(zhì)α-syn、TH的相對表達(dá)水平

冰上取小鼠中腦黑質(zhì)，蛋白提取按照RIPA細(xì)胞組織裂解液說明書進(jìn)行，蛋白定量按BCA方法進(jìn)行，取40 μg總蛋白首先進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后依次轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后曝光顯色，最后利用Image J軟件計算PVDF條帶上的灰度值，α-syn、TH蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值為α-syn 、TH蛋白的相對表達(dá)量。分析腦組織α-syn、TH相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VD3對PD小鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

第21天，與對照組比較，模型組停留時間、爬桿時間延長，轉(zhuǎn)桿時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，中、高劑量組小鼠的停留時間、爬桿時間縮短，轉(zhuǎn)桿時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 VD3對PD病小鼠行為學(xué)的影響（s，±s，n=8）

表2 VD3對PD病小鼠行為學(xué)的影響（s，±s，n=8）

注 與對照組相比，aP＜ 0.05，aaP＜ 0.01，aaaP＜ 0.001；與模型組相比，bP＜ 0.05，bbP＜ 0.01；與低劑量組相比，cP＜ 0.05

指標(biāo) 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 F值 P值停留時間 2.50±0.92 4.88±1.24aaa 4.00±1.30a 3.00±1.30bb 2.75±1.28bbc 5.246 0.002爬竿時間 12.75±2.12 23.13±3.18aaa 19.50±4.24aa 18.00±3.33aab 16.75±5.41abb 7.882 0.000轉(zhuǎn)桿時間 265.12±42.03 114.12±33.66aaa 138.75±42.84aaa 169.25±35.97aaabb 180.75±39.79aaabbc 17.337 0.000

2.2 VD3對PD小鼠黑質(zhì)α-syn、TH蛋白及mRNA相對表達(dá)水平的影響

與對照組相比，模型組小鼠α-syn的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高、TH的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降；與模型組比較，中、高劑量組小鼠的α-syn的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降、TH的mRNA及蛋白表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與低劑量組比，中、高劑量組小鼠的α-syn的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降、TH的mRNA及蛋白表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1、表3。

表3 VD3對PD小鼠α-syn、TH蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=8）

表3 VD3對PD小鼠α-syn、TH蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=8）

注 與對照組相比，aP＜ 0.05，aaP＜ 0.01，aaaP＜ 0.001；與模型組相比，bP＜ 0.05，bbP＜ 0.01，bbbP＜ 0.001；與低劑量組相比，cP＜ 0.05，ccP＜ 0.01；α-syn ：α-突觸核蛋白；TH：酪氨酸羥化酶

指標(biāo) 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 F值 P值α-syn 0.38±0.17 1.22±0.25aaa 1.08±0.21aaa 0.75±0.14aaabbbcc 0.81±0.14aaabbbcc 23.913 0.000 TH 1.05±0.13 0.52±0.15aaa 0.57±0.16aaa 0.72±0.15aaabbc 0.76±0.12aaabbc 17.071 0.000 α-syn mRNA 0.37±0.10 1.36±0.22aaa 1.02±0.26aaabb 0.76±0.18aaabbbc 0.74±0.17aaabbbcc 27.617 0.000 TH mRNA 1.01±0.07 0.55±0.20aaa 0.49±0.18aaa 0.74±0.20aabcc 0.79±0.16abbcc 12.562 0.000

圖1 α-syn、TH蛋白印跡條帶圖

3 討論

VD是一種神經(jīng)營養(yǎng)素，是一種神經(jīng)遞質(zhì)的誘導(dǎo)劑，與VD受體作用發(fā)揮抗炎作用[1，9]。酪氨酸羥化酶是合成多巴胺的關(guān)鍵酶，VD能刺激酪氨酸羥化酶的表達(dá)，VD通過調(diào)節(jié)多巴胺的合成發(fā)揮作用[10-11]。據(jù)研究，補(bǔ)充VD的嚙齒動物，黑質(zhì)的神經(jīng)元存活率提高，氧化損傷降低，多巴胺水平升高[12-15]，白介素-6和脂質(zhì)過氧化物表達(dá)減少[14]。本研究PD小鼠模型為亞急性小鼠模型，采用MPTP腹腔注射7 d制備[7]，與正常對照組比較，模型組小鼠停留時間、爬桿時間延長，轉(zhuǎn)桿時間縮短，模型組小鼠的運動能力下降，符合PD小鼠的行為特征，說明造模成功。不同劑量的VD3治療PD小鼠后，中、高劑量組小鼠的運動能力較模型組明顯改善，推測VD3對PD小鼠有治療作用。

α-syn與PD的發(fā)病關(guān)系密切，α-syn錯誤折疊、異常聚集[1-2]，其是PD典型病理改變路易小體的主要成分。酪氨酸在TH的作用下生成左旋多巴，左旋多巴脫羧生成多巴胺，TH是多巴胺合成的關(guān)鍵酶。本研究中PD小鼠給予不同劑量VD3干預(yù)后，中、高劑量組PD小鼠黑質(zhì)α-syn的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降、TH的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，說明VD3通過抑制黑質(zhì)α-syn、升高TH活性，改善PD小鼠的運動癥狀。從臨床表現(xiàn)到蛋白分子水平，證實VD3對PD小鼠有保護(hù)作用。

雖然本研究為VD3治療PD提供了一定的基礎(chǔ)研究結(jié)果，但VD3應(yīng)用于臨床還有待于VD3的藥理作用的深入研究及多中心的臨床研究。α-syn的異常聚集被認(rèn)為是PD致病的關(guān)鍵因素，α-syn通過介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能異常導(dǎo)致血腦屏障破壞，通過小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎性因子的釋放，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡。