香蕉種苗中枯萎病菌和細菌性軟腐病菌實時熒光PCR檢測

梁基校 陳東 利齊欣 林鴻生 張景欣 楊祁云 王飛釗 蒲小明

摘要：香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌復合侵染且潛伏期較長，建立香蕉種苗病害早期監測的分子檢測方法非常重要。本文基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1，FOC1）基因組Contig 438區間（35631～37693 bp）（GenBank： AMGP01000438.1）設計特異擴增引物qFOC1-F/-R、4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，FOC4）基因組Contig 195區間（4028～6126 bp）（GenBank： AMGQ01000195.1）設計特異擴增引物qFOC4-F/-R，同時以香蕉細菌性軟腐病菌Dickeya zeae的促旋酶B 亞單位基因（Subunit B of gyrase gene）（GenBank： JQ284039）序列設計特異擴增引物qgyrB-F/-R。qPCR檢測結果顯示：實時熒光檢測引物擴增特異性強。通過擬合曲線方程分析得到：檢測香蕉枯萎病菌的DNA濃度最低限為3 pg·μL-1，細菌性軟腐病菌的菌液濃度最低限靈敏度為70 cfu·mL-1，檢測靈敏度較高，結果穩定可靠。因此，本研究建立的實時熒光PCR檢測方法可有效應用于檢測香蕉種苗中的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌，確保種苗的安全生產。

關鍵詞：尖孢鐮刀菌古巴專化型1號菌；尖孢鐮刀菌古巴專化型4號菌；玉米迪基氏菌；實時熒光PCR；檢測

中圖分類號：S432.1 文獻標志碼：A

Detection of Fusarium Wilt and Bacterial Soft Rot of Banana Seedlings by Real-Time Fluorescence Quantitative PCR

LIANG Jixiao2， CHEN Dong3， LI Qixin2， LIN Hongsheng5， ZHANG Jingxin1， YANG Qiyun1， WANG Feizhao4*， PU Xiaoming1*

（1Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 2Institute of Agricultural Science Research of Yangdong District in Yangjiang City， Yangjiang， Guangdong 529900， China; 3Boluo County Supply and Marketing Cooperative Association， Boluo， Guangdong 516100， China; 4Guangdong Tianhe Agricultural Materials Co.， Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510080， China; 5Shanwei Supply and Marketing Zhonghe Agricultural Technology Service Co.， Ltd ， Haifeng， Guangdong 516400， China）

Abstracts： Establishing a molecular detection method for early monitoring of banana seedling diseases is important because of mixed infection and long incubation of banana Fusarium wilt and bacterial soft rot pathogens. The specific amplification primers of qFOC1-F/-R were designed based on the sequences of the contig 438 （35631-37693 bp） （AMGP01000438.1） in the DNA of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 （FOC1） and qFOC4-F/-R based on the contig 195 （4028-6126 bp） （AMGQ01000195.1） in the DNA of F. oxysporum f. sp. cubense race 4 （FOC4）. Based on sequence of subunit B of gyrase gene of banana Fusarium wilt pathogen （GenBank： JQ284039）， Dickeya zeae， the primers of qgyrB-F/-R were designed. The results of qPCR showed that the specificity of primers amplification was very strong. Curve-fitting equation analysis showed that： the minimum limit of DNA concentration for detection of F. oxysporum f. sp. cubense was 3 pg·μL-1， and the sensitivity detection of D. zeae was 70 cfu·mL-1; with high sensitivity if the detection， the results were stable and reliable. Therefore， the qPCR detection method developed in this study is effective to detect banana Fusarium wilt and bacterial soft rot pathogens of banana seedlings to ensure the safe production of seedlings.

Keywords： Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 1; Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 4; Dickeya zeae; real-time fluorescence quantitative PCR; detection

香蕉枯萎病和細菌性軟腐病已成為香蕉種植過程的主要土傳病害，且這兩種病害復合侵染，具有較長的潛伏期，給香蕉種植帶來非常大的風險。目前香蕉種植戶主要通過購買香蕉苗移栽的方式進行生產，所以種苗病害的檢測與監測非常重要，是阻遏香蕉土傳病害為害的重要屏障。

香蕉枯萎病和細菌性軟腐病均為系統性侵染病害，已發病的植株采用常規PCR[1-2]很容易檢出，但對于初期侵染及種苗帶菌采用常規PCR難檢測到病菌；實時熒光定量PCR[3-4]具有更高的靈敏度，是目前香蕉病害早期診斷和種苗帶病菌檢測的有效手段。基因組信息比較發現：尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1，FOC1）基因組Contig 438區間（35631～37693 bp）（GenBank： AMGP01000438.1）[5]和4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，FOC4）基因組Contig 195區間（4028～6126 bp）（GenBank： AMGQ01000195.1）[5]存在160bp插入序列差異，基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號和4號生理小種的基因特定片段序列差異以及香蕉細菌性軟腐病菌基因組[6] 中的促旋酶的B亞單位蛋白基因（gyrB， GenBank： JQ284039）[7] 等設計特異引物來擴增特異基因片段，并建立了實時熒光PCR方法檢測種苗是否帶病菌，為香蕉種苗的土傳病害預警預防提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的香蕉枯萎病菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種FOC1和尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種FOC4，香蕉細菌性軟腐病菌為玉米迪基氏菌（Dickeya zeae MS1），以上菌株均由廣東省農業科學院植物保護研究所提供。

1.2 特異性引物設計

基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種基因組Contig 438區間（35631～37693 bp）（GenBank： AMGP01000438.1）[5]設計特異擴增引物qFOC1-F/-R、4號生理小種基因組Contig 195區間（4028～6126 bp）（GenBank： AMGQ01000195.1）[5]設計特異擴增引物qFOC4-F/-R，且兩片段存在160bp插入差異序列，即設計擴增引物FOC-F/-R；同時以香蕉細菌性軟腐病菌（D. zeae）的促旋酶B亞單位基因（Subunit B of gyrase gene）（GenBank： JQ284039）[7]序列設計特異擴增引物gyrB-F/-R和qgyrB-F/-R。引物序列及片段大小如表1所示。

1.3 菌株基因組提取

香蕉枯萎病菌株于PDA液體培養基中，26～28 ℃培養72 h，過濾取菌絲體，液氮磨成粉末，采用CTAB法[8]提取真菌基因組DNA，采用Thermo NanoDrop ND-2000C超微量紫外/可見分光光度計（美國）測定DNA濃度，?20 ℃保存備用。

香蕉細菌性軟腐病菌株于LB培養中，32 ℃培養24 h，適當菌液濃度用作PCR模板。

1.4 引物特異性擴增

以DNA為模板，使用定性和定量特異引物進行PCR擴增，條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min；將擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察電泳條帶是否有非特異性條帶。

1.5 實時熒光PCR擴增條件

實時熒光PCR擴增體系如下：模板0.5 μL，引物F為0.5 μL，引物R為0.5 μL，Takara 2x TB Green? Fast qPCR Mix 10 μL，補足水至20 μL；儀器BIO-RAD C1000 TouchTM Thermal Cycler反應程序如下：95 ℃反應2 min，95 ℃下15 s，59 ℃下30 s，然后72 ℃下35 s，40個循環。

1.6 檢測限分析

香蕉枯萎病菌1號生理小種和4號生理小種提取的DNA采用超純水稀釋成系列濃度，即? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3×10-1 μg·μL-1、3×10-2 μg·μL-1、3×10-3 μg·μL-1、? ? ? ? ? 3×10-1 ng·μL-1、3×10-2 ng·μL-1、3×10-3 ng·μL-1、? ? ? ? ? ?3×10-4 ng·μL-1；香蕉細菌性軟腐病菌菌液采用超純水稀釋成系列濃度，即7×106 cfu·mL-1、? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?7×105 cfu·mL-1、7×104 cfu·mL-1、7×103 cfu·mL-1、? ?7×102 cfu·mL-1、7×101 cfu·mL-1、7×100 cfu·mL-1。

采用引物qFOC1-F/R擴增尖鐮孢菌古巴專化型1號生理小種DNA，采用引物qFOC4-F/R擴增尖鐮孢菌古巴專化型4號生理小種DNA，采用引物qgyrB-F/R 擴增香蕉細菌性軟腐病菌菌液；DNA和菌液稀釋成系列濃度作為qPCR擴增體系模板，每處理重復4次，根據Ct值與對應模板菌體量，擬合函數方程，計算檢測最低靈敏度。

1.7 種苗場抽檢

在廣州市番禺和南沙隨機選取了5個香蕉種苗場，每個苗場隨機抽取30棵苗，取香蕉苗基部球莖組織，切碎后用液氮磨成粉末，采用CTAB法[18]提取總DNA，-20 ℃保存備用。普通PCR采用方法1.3擴增樣品DNA，實時熒光PCR采用方法1.4擴增樣品DNA，并分析種苗檢出病菌情況。

2 結果與分析

2.1 引物特異性擴增

香蕉枯萎病菌與細菌性軟腐病菌的定量PCR檢測引物擴增效果特異，無非特異性條帶出現，可作為定量PCR檢測的特異引物（圖1）。

2.2 尖鐮孢菌古巴專化型1號生理小種的分子檢測

由圖2可知，實時熒光定量PCR檢測分析說明，擴增曲線和溶解曲線峰形單一，準確性較高。依照定量PCR的Ct值（Y）與DNA濃度（X），擬合曲線方程（圖3）：Y=-1.54ln（X）+16.772，? ? ? ? ? ? ? ? ? ? R2=0.9967，FOC1的DNA濃度檢測最低限值為? ? ? ? ? ?3 pg·μL-1。

2.3 尖鐮孢菌古巴專化型4號生理小種的分子檢測

由圖4可知，實時熒光定量PCR檢測分析說明，擴增曲線和溶解曲線峰形單一，準確性較高。依照定量PCR的Ct值（Y）與DNA濃度（X），擬合曲線方程（圖5）：Y= -1.406 ln（X）+18.455，? ? ? ? ? ? ? R2=0.9943，FOC4的DNA濃度檢測最低限值為? ? ? ? ? ? ? ?3 pg·μL-1。

2.4 香蕉細菌性軟腐病菌分子檢測

由圖6可知，實時熒光定量PCR檢測分析說明，擴增曲線和溶解曲線峰形單一，準確性較高。依照定量PCR的Ct值（Y）與菌濃度（X），擬合曲線方程（圖7）：Y=-1.522ln（X）+ 41.851，? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?R2=0.9986，菌濃度檢測最低限值為70 cfu·mL-1。

2.5 種苗檢測

采樣實時熒光PCR檢測方法分析廣州番禺和南沙5個香蕉種苗場的抽檢種苗的帶病菌情況，結果如表2所示。5個種苗場有4個種苗場都分別檢出了香蕉種苗帶香蕉枯萎病菌、香蕉細菌性軟腐病菌或兩種病害病原菌同時檢出，說明這些種苗場存在病害傳播風險；只有香蕉兩種病害病原菌均未檢出的裕星種苗場符合無毒種苗生產要求。結果也表明：普通PCR分析方法均無法檢測到帶病菌情況，說明了本文建立的針對于香蕉枯萎病和細菌性軟腐病的實時熒光PCR方法能有效用于種苗病害檢測與監測。

3 討論與結論

本研究建立的實時熒光PCR檢測方法具有較高的靈敏度，相比較對應的普通PCR檢測方法，香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種DNA的檢測靈敏度由100 pg·μL -1提高到3 pg·μL -1，靈敏度提高33.3倍；香蕉細菌性軟腐病菌的檢測菌濃度靈敏度由1.0×103 cfu·mL-1提高到70 cfu·mL-1，靈敏度提高14.3倍；在香蕉種苗場種苗抽檢中，該實時熒光PCR檢測方法可有效準確檢測出種苗帶病菌情況。

實時熒光PCR技術在普通PCR擴增中設計更小片段擴增產物，并在體系中添加熒光染料或熒光標記的分子探針，利用熒光信號強度間接分析靶標DNA含量，更適用于香蕉病害病原菌低含量的檢測[9]。與常規PCR方法比較，實時熒光定量PCR可實時觀測結果，也可以定量計算菌量，且實時熒光定量PCR方法還具有更高的特異性和靈敏度[4]，比普通的 PCR方法靈敏度高100倍左右[10]。實時熒光PCR可以更準確可靠地定量和定性檢測植物組織和土壤中的尖孢鐮刀菌及其他病原菌[11-13]。豆亞亞等[14]建立實時熒光PCR檢測方法對的香蕉軟腐病菌的菌懸液的檢測靈敏度可達到? ? 4.0×102 cfu·mL-1，比常規PCR高100倍；而本文建立的方法對香蕉軟腐病菌的菌懸液的檢測靈敏度比豆亞亞等報道結果提高了5.7倍，檢測靈敏度明顯更高。LIN等構建了實時熒光方法定量檢測發病香蕉組織中香蕉枯萎病4號生理小種，檢測基因組DNA最低限達100 pg·μL-1，檢測靈敏度明顯提高[15]。魏森等[16]建立了一套較準確檢測土壤 FOC4數量的實時熒光定量PCR技術，其檢測孢子下線可達400個/g；饒雪琴等[17]采用實時熒光PCR分析了FOC1和 FOC4菌量在‘巴西蕉植株和根際土壤中具有明顯不同的時空分布；YANG等[18]建立的TaqMan 探針實時熒光檢測方法，靈敏度可達10 pg·μL-1。AGUAYO等[3]基于致病相關基因構建了香蕉枯萎病4號生理小種探針實時熒光檢測方法，靈敏度達103 pg·μL-1；而本文建立的方法對香蕉枯萎病基因組DNA的檢測靈敏度達到3 pg·μL -1，檢測靈敏度和效率大幅度提高。

本文建立的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的實時熒光PCR檢測方法可有效用于香蕉種苗檢疫和田間香蕉病害早期診斷，有效防控香蕉枯萎病和細菌性軟腐病為害，及早發現及早干預，優化合理種植計劃，保護種植戶利益和促進農業安全生產。

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責任編輯：謝紅輝

基金項目：廣東省現代農業產業綠色發展共性關鍵技術研發創新團隊建設項目（2022KJ112）；廣東省煙草科技項目（201802，201908，202201）；廣東絲苗米跨縣集群產業園（汕尾市）項目（2022—2023）；博羅蔬菜產業科技支撐項目（2022—2023）。

第一作者：梁基校（1981—），男，本科，農藝師，專業為農學，E-mail：53570050@qq.com。

*通信作者：蒲小明（1981—），男，博士，研究員，研究方向為農作物病蟲害綜合防控，E-mail：pxm1981@126.com;? ? ? 王飛釗（1988—），男，碩士，農藝師，研究方向為農藥研究與應用，E-mail：wangfz@gd-tianhe.com。

收稿日期：2023-09-01