褪黑素單克隆抗體的制備

武海新，廖晨星，常 毅，馬 慧，劉巧香，李有志，郭 剛*，劉國世*

1 北京市中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193 2 北京首農食品集團有限公司，北京 100028 3 山東省飼料獸藥質量檢驗中心，山東濟南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT）又稱為抑黑素或美拉酮寧，哺乳動物體內由松果體釋放，廣泛存在與消化道、生殖系統、循環系統等部位，調節動物的晝夜節律，同時也具有調節免疫功能[1]、抗衰老[2]、抗腫瘤[3]、調節骨骼生長[4]等廣泛的生物學作用。本研究采用動物免疫、制備雜交瘤細胞的方法，制備高特異性褪黑素單克隆抗體。以該褪黑素單克隆抗體為材料，能夠進一步開發褪黑素快速檢測方法，為生物和畜牧領域的科研和生產提供便利。同時該抗體可作為進一步研究褪黑素體內外功能及機理的材料工具，為后續的科研工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠[6～8 周齡，（18±2）g]，揚州大學提供；褪黑素（CAS號：73-31-4）、卵清白蛋白（OVA）、EDC、NHS、弗氏佐劑，Sigma公司；羊抗鼠-HRP，南京鐘鼎生物公司；透析袋、0.22 μm無菌濾器，Millipore公司；高糖DMEM培養基，Gibco公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，南京諾唯贊公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

將10 mg褪黑素溶解于NaOH水溶液，加熱反應6 h，加入鹽酸中和過量堿，過硅膠層析柱純化，得到產物8 mg，溶于200 μLDMF中。稱取BSA和OVA各10 mg分別溶于2 mL 0.01 mol/L PBS中，將100 μL衍生物滴加到OVA中，然后各加入10 mgEDC、10 mgNHS，室溫攪拌5 h，PBS透析3 天，期間換液6次，取出分裝備用。

1.2.2 動物免疫

選取6～8 周齡BALB/c小鼠5 只，將褪黑素-OVA與弗氏佐劑混合，50 μg/只進行皮下注射，2～3 周后加強免疫。采血，通過間接ELISA方法確定抗血清針對褪黑素-OVA的滴度。

1.2.3 抗血清滴度檢測及篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標板中，每孔100 μL，4 ℃過夜；丟棄包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃恒溫箱1 h；取出酶標板，棄去包被液，洗板1次；將抗血清從1∶500起3 倍梯度稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀釋好的酶標二抗（山羊抗鼠-HRP，1∶20 000）；37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板4次，每孔加入100 μL TMB顯色液，根據顏色的深淺決定顯色時間，一般37 ℃，15 min；每孔加入100 μL 1 mol/L HCL溶液，終止反應；即刻在酶標儀上讀數，450 nm處樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔。

1.2.4 骨髓瘤細胞制備

提前1 周用含有10%FBS的DMEM培養基將SP2/0細胞擴大培養。細胞融合當天將SP2/0細胞移入50 mL離心管中，離心1 500 r/min，5 min；丟棄上清，加入DMEM基礎培養基，吹打細胞并計數。

1.2.5 脾細胞制備

選擇血清ELISA滴度達到1∶121 500的小鼠，在融合前3 天終止免疫，腹腔注射褪黑素-OVA 100 μg；融合當天將小鼠進行安樂死處死；在75%酒精中浸泡5 min；在無菌條件下取出脾臟，把脾臟放入培養皿中的DMEM基礎培養基中；使用注射器內心研磨脾臟，并用細胞篩過濾，然后用DMEM沖洗篩網。將過濾后懸液轉移至50 mL離心管，用不含血清的DMEM清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；用紅細胞裂解液去除紅細胞，用不含血清的DMEM再清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；鋪板計數。

1.2.6 細胞融合

將脾細胞和骨髓瘤細胞混合，使脾細胞與骨髓瘤細胞數量比為2∶1；將細胞移至50 mL離心管中，用DMEM基礎培養基稀釋，離心1 500 r/min，5 min，棄去上清，搖動離心管使細胞均勻；用電融合液洗細胞1次，然后離心1 500 r/min，5 min，棄上清；用電融合液將細胞稀釋成2×107個/mL，然后在融合池中加入2 mL細胞懸液進行電融合上機試驗，電擊后靜置10 min；使用高糖DMEM培養基，把融合好的細胞鋪至96 孔板，每孔100 μL；將96孔板放于CO2培養箱中培養；10 天后進行融合篩選檢測。

1.2.7 融合篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標板中，每孔100 μL，4 ℃過夜。次日吸取100 μL/孔細胞上清進行ELISA檢測；根據ELISA結果，樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔；對二次確認后的陽性孔細胞進行亞克隆。

1.2.8 細胞亞克隆

吹打陽性孔細胞并計數，使用有限稀釋法對融合細胞進行稀釋，并接種至96孔板。7～10天后在顯微鏡下觀察，檢測有克隆生長的孔并做好標記，挑取陽性的單克隆細胞進行再次亞克隆，重復至檢測達100%陽性后，挑出單克隆孔進行擴大培養并凍存。

1.2.9 亞克隆篩選

操作方法同1.2.7。

1.2.10 抗體純化

在親和純化層析柱中裝入Protein A瓊脂糖凝膠介質，將3G3D1細胞上清緩慢上樣，待抗體結合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，在PBS中進行4 ℃透析過夜，次日進行純度與濃度測定。

1.2.11 抗體鑒定

通過ELISA檢測純化抗體滴度，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定所得抗體濃度。

1.2.12 純化抗體ELISA滴度檢測

操作方法同1.2.3。

1.2.13 抗體純度鑒定

純化后抗體進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。

2 結果

2.1 免疫小鼠抗血清滴度檢測

通過對5 免后鼠抗血清與褪黑素-OVA滴度檢測，1#、3#小鼠抗血清針對褪黑素-OVA滴度能夠達到121 500，2#、4#、5#小鼠抗血清針對褪黑素-OVA滴度能夠達到40 500（表1）。通過競爭ELISA方法確定抗血清針對褪黑素競爭抑制率，3#小鼠抗血清針對褪黑素有競爭性（表2）。

表1 5免后7 天對小鼠血清抗體滴度檢測結果

表2 5免后7 天小鼠血清競爭滴度檢測結果

2.2 融合細胞篩選

將骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞進行電融合，鋪板10 天后進行ELISA篩選檢測。通過兩輪ELISA篩選，得到5 株OD值高于0.5的融合細胞（1H12、2C5、2C9、3G3、4C11）（表3）。進一步通過ELISA篩選檢測，獲得1 株針對褪黑素-OVA特異性最高的融合細胞株（3G3）（表4）。

表3 融合細胞ELISA篩選結果

表4 融合細胞上清競爭ELISA篩選結果

2.3 雜交瘤細胞株的建立

將骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞融合后，經過3 輪細胞亞克隆和ELISA篩選（表5），獲得針對褪黑素-OVA具有高特異性的陽性單克隆細胞株5 株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）（圖1）。

表5 亞克隆細胞上清競爭ELISA篩選結果

圖1 篩選出的陽性雜交瘤細胞

2.4 純化抗體滴度鑒定

選擇3G3D1這株單克隆細胞株進行抗體純化。經ELISA滴度檢測可達1∶64 000，純化抗體ELISA檢測結果如表6所示。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對純化后抗體進行濃度測定，所得3G3D1-抗體濃度為0.28 mg/mL，體積4 mL。

表6 3G3D1純化抗體ELISA檢測結果

2.5 抗體純度鑒定

3G3D1純化抗體SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，出現55 kD、25 kD兩個條帶，符合IgG重鏈與輕鏈分子大小（圖2）。

圖2 純化抗體SDS-PAGE分析

3 討論

褪黑素分子量為232.28 Da。作為一種小分子物質，褪黑素屬于半抗原，無法直接刺激動物產生免疫應答從而產生特異性抗體[5]，因此需要先與蛋白載體相結合，才能實現對動物的免疫過程[6]。本研究中將褪黑素小分子與卵清蛋白OVA進行偶聯，制備出褪黑素-OVA抗原，并通過5 輪免疫成功得到了血清滴度過關的免疫小鼠，并且分離小鼠脾臟制備雜交瘤細胞。經過篩選共獲得5 株陽性雜交瘤細胞，均可穩定分泌褪黑素單克隆抗體。由于3G3D1細胞株對褪黑素-OVA抗原的識別能力最強，因此使用這株細胞進行抗體純化，最終得到單克隆抗體濃度為0.28 mg/mL，滴度可達1∶64 000。因此本研究成功制備出針對褪黑素小分子物質的高特異性單克隆抗體。

褪黑素是一種哺乳動物體內常見的抗氧化劑和抗炎物質[7]，同時也是調控生殖的重要激素[8]。本研究制備出褪黑素單克隆抗體，為褪黑素含量的快速檢測方法的開發提供材料，也為相關功能性研究奠定基礎。