從病毒性肝炎到肝細胞癌：外泌體microRNA的作用

毛元鵬， 于 哲， 宋阿倩， 魏紅山,

1 北京大學地壇醫院教學醫院 消化科， 北京 100015； 2 首都醫科大學附屬北京地壇醫院 消化科，北京 100015

1983年，Johnstone等[1]首先在綿羊成熟網織紅細胞中發現了外泌體的存在。隨著不斷地深入研究，人們發現外泌體并不只是簡單的細胞廢物碎片。細胞間物質運輸既可完成細胞之間的物質交換，同時也能充當信息傳遞的方式。外泌體作為直徑40～100 nm的膜結合小囊泡，同時承擔著物質運輸和信息傳遞雙重作用[2]。

microRNA(miRNA)是真核生物中的一類小型非編碼RNA，大小為19～25 nt，可在轉錄后調節基因表達[3]。有研究[4]發現，miRNA可以靶向糖基轉移酶mRNA，并誘導其進行降解，進而影響蛋白質的糖基化修飾過程。外泌體中有著豐富的miRNA，不同細胞來源的外泌體，其所含有的miRNA種類也不盡相同。近年來，外泌體miRNA與人類疾病的聯系已逐步得到證實[5-6]。

肝細胞癌(HCC)是由肝實質細胞產生的惡性腫瘤，病毒性肝炎是HCC進展的主要原因之一。HCC的早期診斷較為困難，近年來越來越多的研究集中于外泌體miRNA在HCC臨床診斷和治療中的作用。本文將主要介紹外泌體miRNA與病毒性肝炎相關HCC之間的聯系。

1 外泌體miRNA

1.1 外泌體的來源 目前已證實，外泌體能夠被各種類型的細胞釋放，如巨噬細胞、肝星狀細胞、淋巴細胞、紅細胞及腫瘤細胞等，并且存在于大多數生物體液中[7]。除了蛋白質和脂質外，在外泌體中還發現了各種核酸分子，包括DNA、mRNA、miRNA和其他非編碼RNA[8]。外泌體的產生源自細胞膜內陷。細胞膜內陷后形成早期內體，早期內體膜向內出芽形成多泡體，并且同時加入了miRNA、蛋白質、脂質等選定物質；而后，多泡體既可與細胞膜融合最終形成外泌體，也可與溶酶體融合進行降解[9]。

1.2 外泌體miRNA的來源 miRNA從產生到進入外泌體有著復雜精細的過程。細胞核中負責編碼miRNA的DNA序列在RNA聚合酶Ⅱ的催化下轉錄產生初級miRNA(pri-miRNA)，生成的pri-miRNA在細胞核中被Drosha-DGCR8復合物切割繼而形成70～100 nt長度的前miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA在Exportin5的幫助下進入細胞質，經Dicer復合物對其進一步加工，而后成熟的雙鏈miRNA轉變為單鏈miRNA，隨即通過不同的分選方式進入外泌體[10]。

2 外泌體miRNA在肝炎病毒復制與傳播過程中的作用

病毒性肝炎是世界范圍內常見的疾病，主要由五種肝炎病毒引起：甲型、乙型、丙型、丁型、戊型。來源于感染肝炎病毒肝細胞的外泌體有助于病毒的傳播，并損害機體對病毒性肝炎的先天免疫反應[11]。HAV能劫持宿主細胞內體囊泡，并將其病毒顆粒包裝于所形成的外泌體中，以促進自身復制和傳播[12]。早期有報道[13]稱，miR-199a-3p和miR-210(二者均可存在外泌體中)的表達上調，能夠有效抑制HBV復制。此外，在HBV感染者中，HBV編碼的miRNA(HBV-miR-3)能通過外泌體攜帶釋放進入循環，而HBV-miR-3可抑制HBV復制和蛋白質的產生[14]。

Ramakrishnaiah等[15]發現，HCV通過外泌體轉運，實現在肝細胞之間的傳播。Bukong等[16]也發現，從HCV及HCV感染者的肝細胞株Huh7.5分離的外泌體中存在HCV RNA，而外泌體miR-122能夠與進入外泌體的HCV RNA、Ago2、HSP90結合形成復合物，增強HCV RNA穩定性并促進復制和傳播。此外，含有HCV的外泌體能夠通過STAT3-miR124軸誘導RUNXOR和RUNX1表達上調，從而幫助病毒逃避宿主免疫反應[17]。機體感染HCV后，Toll樣受體3(TLR3)能夠激活肝巨噬細胞產生外泌體抗病毒miRNA，如miR-29。當外泌體釋放并被其他肝細胞吸收后，其內的抗病毒miRNA能夠誘導抗HCV反應或直接靶向作用于HCV基因表達[18]。

3 外泌體miRNA對肝纖維化進程的調控

隨著病毒性肝炎進一步發展，肝臟出現纖維化表現，其特征是細胞外基質(ECM)過度沉積。肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化過程中被激活，是整個纖維化過程的主要參與者。HSC能分泌外泌體，并且能被其他細胞釋放的外泌體激活。在靜止的HSC中，外泌體miR-214和miR-199a-5p在堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1調節下高表達，能抑制結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CCN)2的mRNA表達水平以及下游纖維化信號傳導，從而抑制纖維化進展；而在激活的HSC中，外泌體miR-214和miR-199a-5p水平較低，CCN2表達升高，膠原蛋白1α沉積增加，從而促進纖維化進程[19-20]。通過使用棕櫚酸處理刺激肝細胞中外泌體的產生，發現外泌體中的miR-122、miR-24、miR-19b、miR3-4a和miR-192水平顯著增加；而HSC攝取棕櫚酸處理的肝細胞來源外泌體后，其纖維化相關基因表達顯著升高[21]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種多能干細胞，通過分泌多種細胞因子發揮作用。有報道[22]稱，MSC來源的外泌體miR-181-5p可以通過激活自噬來抑制肝纖維化進展。最新的一項研究[23]表明，miR-618能通過外泌體從MSC轉移到肝星狀細胞系LX-2細胞內，并且靶向負調控Smad4基因表達，抑制LX-2細胞的活力和遷移，從而緩解肝纖維化的進展。與此類似的是，較早的研究[24]也發現，miR-192可以通過肝細胞衍生的HCV相關外泌體轉移至HSC內，并上調轉化生長因子β1(TGFβ1)水平進而促進HSC轉分化為肌成纖維細胞。

4 外泌體miRNA對病毒性肝炎相關HCC增殖、轉移的影響

病毒性肝炎所致纖維化長期發展，最終可進展成為肝硬化或HCC。

4.1 外泌體miRNA與HCC腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME) TME由腫瘤細胞周圍的ECM、毛細血管、基底膜、活化的成纖維細胞和免疫細胞構成，其有助于腫瘤的進展。既往研究[25-26]已證實，TME中不同類型的基質細胞可以通過轉移外泌體miRNA與腫瘤細胞進行細胞間通訊。在類似TME的活化LX-2細胞和HCC細胞共培養系統中，LX-2細胞中外泌體和miR-148a-3p水平均降低，促進了HCC細胞的增殖和侵襲；而當HCC細胞攝取過表達miR-148a-3p的外泌體后，腫瘤發展受到顯著抑制[27]。眾所周知，環境化學物質可以誘導正常細胞向病理細胞的轉變。由亞砷酸鹽轉化的人肝上皮細胞L-02分泌的外泌體miR-155能夠誘導正常肝細胞中炎癥因子IL-6和IL-8高表達，而IL-6與亞砷酸鹽誘導的致癌作用密切相關[28]。

4.2 外泌體miRNA與癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAF) CAF可通過增加血管生成、增殖、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)和逃避免疫監視來促進HCC進展[29]。活化的HSC是肝臟中CAF的主要來源。HCC細胞來源外泌體miR-21能直接靶向HSC內腫瘤抑制基因PTEN，降低其翻譯產物磷酸化水平，導致HSC中PDK1/AKT信號通路激活，促進HSC活化為CAF[30]。據報道[31]，高轉移性HCC細胞分泌的外泌體miR-1247-3p能直接靶向成纖維細胞內的β-1,4-半乳糖基轉移酶Ⅲ(B4GALT3)，通過激活B4GALT3/β1-整合素/NF-κB軸，誘導成纖維細胞活化為CAF，促進HCC肺轉移。另外，由CAF分泌的外泌體miRNA也能夠影響TME內HCC細胞的生長和表型[32]。一項研究[33]表明，CAF來源外泌體miR-150-3p的缺失極大地促進了HCC的進展，并且血漿低水平外泌體miR-150-3p的患者存活率顯著低于高水平患者。

4.3 外泌體miRNA與HCC細胞EMT 包括HCC在內的癌轉移是一個多步驟過程。EMT是腫瘤細胞獲得轉移、侵襲能力的重要條件，其特征是上皮樣特征的喪失和間充質樣屬性的獲得。外泌體miRNA能通過影響EMT過程間接影響HCC發展。miR-320a是一種抗腫瘤miRNA。Xie等[34]研究發現，miR-320a在HCC樣本和HCC細胞系中均顯著下調，而促癌基因c-Myc卻表達上調。進一步研究發現，c-Myc是miR-320a的直接靶點，miR-320a能通過抑制c-Myc表達來抑制HCC的增殖和轉移[34]。miR-320a與HCC細胞EMT也有著重大關聯。近期的一項研究[35]發現，外泌體miR-320a可以通過與其直接下游靶標PBX3結合來抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活，進而抑制EMT過程，最終使HCC細胞的增殖、遷移受到抑制。該團隊進一步研究[35]發現，CAF來源外泌體中miR-320a水平顯著降低，miR-320a-PBX3-MAPK信號通路受到抑制，誘導了EMT發生以及細胞周期蛋白依賴性激酶2和基質金屬蛋白酶2的表達，促進了HCC細胞的生長和轉移。此外，使用TGFβ誘導HCC細胞系Hep3B細胞EMT發生，發現Hep3B細胞來源外泌體中miR-374a-5p水平顯著增加，并且促進了HCC癌細胞的增殖和轉移；而在干擾miR-374a-5p表達后會抑制HCC癌細胞的增殖和遷移[36]。

4.4 外泌體miRNA與HCC腫瘤組織新生血管形成 成熟癌細胞往往通過循環途徑轉移至其他組織或器官，新生血管的形成對于癌組織的生長和轉移至關重要。Lin等[37]發現，HCC患者血清中miR-210水平與HCC組織中的微血管密度相關。進一步的體內、體外研究[38]發現，HCC細胞分泌的外泌體miR-210可以運輸至血管內皮細胞中，靶向抑制SMAD4和STAT6基因，導致二者蛋白產物水平降低，進而促進腫瘤組織血管生成。此外，HCC細胞分泌的外泌體miR-103也可以進入血管內皮細胞中，通過靶向抑制內皮細胞-細胞接觸黏附分子VE-Cad、p120-catenin (p120)和ZO-1的表達，破壞內皮細胞連接的完整性，從而增加血管通透性，促進腫瘤的轉移。

總而言之，外泌體miRNA在病毒性肝炎所致HCC的起始、形成、成熟和轉移整個過程中都有著重要作用(表1，圖1)。

表1 部分外泌體miRNA對HCC的影響

圖1 外泌體miRNA與病毒性肝炎相關HCC的關系

5 小結和展望

關于外泌體治療HCC的策略已經有了大量研究，然而對于外泌體miRNA在病毒性肝炎所致HCC發生發展中的作用研究尚為有限，尤其是其在炎-癌轉化過程中的作用仍然需要進一步探索。其他細胞來源外泌體在被病毒性肝炎感染的肝細胞攝取后，其內所含miRNA對肝細胞內糖基轉移酶基因及其mRNA表達水平的調節，可能是影響感染肝細胞向癌細胞轉變過程中表型和功能發生改變的重要因素。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：毛元鵬負責擬定寫作思路，撰寫論文；于哲、宋阿倩參與收集文獻，分析資料；魏紅山負責課題設計，指導撰寫論文并最終定稿。