錯配修復蛋白與結直腸癌病理特征及預后的關系研究

李 冰

廣東省佛山市復星禪誠醫院 528000

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤，在惡性腫瘤中發病率居第三位。CRC發病隱匿，早期診斷率不足15%，多數患者首診時即為晚期階段。盡管目前CRC的治療策略及療效已有明顯改善，但仍有約50%的患者術后復發或轉移，遠期生存率仍差強人意。因此尋找與CRC預后相關的有效生物標志物，通過更積極的治療使患者獲益是目前CRC診療研究的熱點和難點。已有研究證實，微衛星不穩定(Microsatellite instability，MSI)是結直腸癌形成的內在分子通路機制之一，MSI由錯配修復蛋白缺失(deficient mismatch repair，dMMR)引起[1-2]。本研究旨在探討CRC患者MMR表達及CTCs與臨床病理特征和預后的關系，以期為CRC的預后評估提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年3月—2020年3月我院收治的148例行手術治療的CRC患者，年齡35～79(64.65±9.48)歲；男99例，女49例。(1)納入標準：①術后經病理明確診斷為CRC；②接受CRC根治術治療；③術前無放療和化療史；④研究經院倫理委員會通過且患者知情同意。(2)排除標準：①合并其他系統原發性腫瘤者；②腫瘤組織未行免疫組織化學分析(IHC)者；③隨訪資料不完整者。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學法(IHC)檢測MMR蛋白：所有標本均經過10%中性緩沖福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后的組織標本，3μm連續切片至防脫玻片上，60℃恒溫箱中加熱約2h。脫蠟修復后，使用上?；蚩萍脊咎峁┑娜詣用庖呓M化儀進行免疫組化染色。免疫組化抗體包括：一抗MLH1(鼠單抗，克隆號：ES05)、MSH2(鼠單抗，克隆號：25D12)、MSH6(兔單抗，克隆號：EP49)、PMS2(兔單抗，克隆號：EP51)。結果判定標準：任何一個蛋白缺失為dMMR，所有四個蛋白表達均陽性為錯配修復功能完整(proficient mismatch repair，pMMR)。陽性對照為扁桃體、闌尾，陽性內對照為腫瘤細胞周圍的纖維和纖維母細胞、淋巴細胞，正常腸黏膜上皮。陽性定位為細胞核。陽性結果的判定：陽性對照陽性表達并且內對照陽性，腫瘤細胞核著色。陰性結果的判定：陽性對照陽性表達并且內對照陽性，腫瘤細胞核不著色。

1.2.2 隨訪：所有患者術后隨訪觀察3年，術后隨訪以門診隨診方式進行，記錄患者隨訪期內生存情況，總生存率(Overall survival，OS)計算終點為各種因素導致的死亡。

1.3 統計學方法 使用SPSS20.0軟件進行數據統計分析，計數資料采用n表示，采取χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，并使用Log-rank法進行顯著性檢驗；使用COX單因素和多因素分析確定影響CRC患者OS的獨立危險因素。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC患者MMR功能狀態情況 148例CRC患者中，dMMR患者18例(12.16%)，pMMR患者130例(87.84%)；其中PMS2聯合MLH1缺失10例，MSH6缺失4例，PMS2缺失2例，MSH2聯合MSH6缺失2例。

2.2 MMR功能狀態與CRC患者臨床病理特征關系 CRC患者MMR功能狀態與性別、年齡、腫瘤部位、CEA水平無關(P>0.05)，與TNM分期、淋巴結轉移及分化程度有關(P<0.05)；其中Ⅲ、Ⅳ期CRC患者dMMR比例低于Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)，合并淋巴結轉移者dMMR比例低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，低分化CRC患者dMMR比例高于中高分化患者(P<0.05)。見表1。

表1 MMR功能狀態及CTCs表達與CRC患者臨床病理特征關系

2.3 MMR功能狀態與CRC患者預后關系 隨訪期內，148例CRC患者共有57例(38.51%)死亡，分析發現dMMR組實際生存率(77.78%，14/18)明顯高于pMMR組(59.23%，77/130)(P<0.05)；Kaplan-Meier生存曲線分析顯示dMMR組整體生存情況優于pMMR組，見圖1。

圖1 MMR與CRC患者預后關系的Kaplan-Meier生存曲線分析

2.4 影響CRC患者預后生存的COX回歸分析 COX單因素回歸分析結果顯示，年齡≥60歲，TNM分期Ⅲ/Ⅳ、合并淋巴結轉移、低分化是CRC患者的不良預后因素(P<0.05)，dMMR是CRC患者預后的保護因素(P<0.05)。進一步行COX多因素回歸分析，結果表明：TNM分期Ⅲ/Ⅳ、合并淋巴結轉移、低分化是CRC患者OS的獨立危險因素(P<0.05)，dMMR是CRC患者OS的獨立保護因素(P<0.05)。見表2、表3。

表2 影響CRC患者OS的COX單因素分析

表3 影響CRC患者OS的COX多因素分析

3 討論

目前CRC仍采取以手術為主，放化療為輔的綜合治療策略。但基于CRC異質性及個體化差異，臨床診療方案及預后具有較大差異[3]。當前，TNM系統仍然包括CRC在內的各種實體腫瘤治療及預后評估的主要依據，但是其局限性日益凸顯，具有相同TNM分期的CRC患者其治療方法及預后不盡相同。在此背景下，MMR逐漸成為CRC診療中備受關注的分子標志物[4-5]。目前臨床上MMR功能缺陷主要采用IHC法檢測，即受檢腫瘤組織中出現MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等任一MMR蛋白缺失時即為dMMR。根據相關研究報道，dMMR檢出率為10%～20%[6-7]。本研究中，dMMR總檢出率為12.16%，符合上述報道的結果。與pMMR CRC相比，dMMR CRC已被發現具有獨特的生物學特性，其相對好發于右半結腸、淋巴結轉移率低。本組病例中，CRC患者MMR功能狀態與性別、年齡、CEA水平無關，與以往研究中的研究結果相符合。另外本組病例中MMR功能狀態與腫瘤部位無關(P=0.053)，而以往有研究[8]指出dMMR在腫瘤部位位于右半結腸的CRC患者檢出率較高，筆者分析這可能與本研究納入的樣本量較小影響了統計效能有關。本研究結果顯示，MMR功能狀態與TNM分期、淋巴結轉移及分化程度有關；其中Ⅲ、Ⅳ期，合并淋巴結轉移，中高分化CRC患者dMMR比例分別低于Ⅰ、Ⅱ期，無淋巴結轉移，低分化CRC患者，或可提示患者預后。臨床上通過檢測MMR功能狀態有助于為患者制定更個體化的治療方案。

在dMMR與胃癌患者預后關系的研究中，dMMR表型胃癌患者的生存率明顯高于非dMMR表型者，提示dMMR表型胃癌患者預后更好。目前，dMMR與CRC患者預后關系的研究仍具有爭議。一項納入12 782名CRC患者的薈萃分析結果顯示，相比pMMR表型CRC患者，dMMR表型CRC患者具有更高的無進展生存率和OS[9]。然而亦有研究發現，dMMR表型CRC患者5年生存率及中位生存時間分別為14%和14.0個月，與總體CRC患者相比并無統計學差異(分別為13%和15.4個月)[10]。本研究發現dMMR組整體生存情況優于pMMR組，COX回歸分析提示dMMR是CRC患者OS的獨立保護因素，提示dMMR可能是CRC潛在的預后標志物。

綜上所述，CRC患者MMR功能狀態與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度密切相關，dMMR是CRC患者預后的獨立保護因素，可能是CRC診療中潛在的生物標志物。本研究不足在于觀察時間尚短，未能獲得遠期生存數據，MMR功能狀態對CRC患者預后的遠期影響有待進一步跟蹤觀察。