場景恐懼記憶過程中小鼠海馬區神經可塑性改變的實驗研究*

歐陽一蕙 陳 思 何本宇

1 清遠職業技術學院，廣東省清遠市 511510； 2 遵義醫科大學珠海校區

創傷后應激障礙(Post-traumatic stress disorder，PTSD)是指機體經歷了威脅生命的應激事件后表現出的遲發性和持續性心理障礙[1]。現有對PTSD的研究通常采用基于典型的巴普洛夫條件反射的條件性恐懼記憶模型來模擬出恐懼記憶的學習、重現和消退過程。對處于曾經的恐懼環境以及線索條件下的動物表現出的僵直行為指數進行評估。

PTSD的病理癥狀涉及的主要腦區為海馬(hippocampus)，被認為是對上下文處理和空間記憶最重要的大腦區域，起著產生、傳遞或鞏固情景恐懼記憶的作用[2]。臨床實驗也證實海馬功能的異常導致 PTSD 患者陳述性記憶的損害以及識別環境安全性的能力缺陷[3]。

樹突棘是興奮性突觸的突出部位，樹突棘密度及形態的變化被認為是突觸可塑性的反映，與記憶的形成與重現密切相關[4]。谷氨酸是哺乳動物中樞神經系統中分布最為廣泛的興奮性神經遞質，其與受體的結合可通過突觸傳遞調控負責信息傳遞的新蛋白的合成，進而形成記憶。谷氨酸攝取和谷氨酸—谷氨酰胺循環對突觸形成及維持突觸可塑性具有重要作用[5]。

然而，在PTSD 中研究谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)的變化鮮有報道，本研究借助恐懼記憶模型研究海馬腦區內樹突棘的改變、重要的神經遞質谷氨酸和主要調控谷氨酸合成的關鍵酶谷氨酰胺合成酶的改變，為PTSD應激狀態下腦區的神經突觸可塑性的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型構建

1.1.1 動物分組：本實驗選用30只清潔級成年雄性C57小鼠，體質量20～30g，由中山大學中山醫學院實驗動物中心提供(動物許可號：SCXK 2011-0029)。實驗期間動物均飼養于實驗動物中心Ⅱ級實驗室，室內恒溫22～25℃。實驗小鼠隨機分成：正常對照組(Ctrl)15只、PTSD 組15只；每組中5只用于樹突棘染色，10只用于Glu 檢測和GS 檢測。

1.1.2 場景恐懼記憶模型構建：訓練箱箱壁由透明有機玻璃組成(20cm×23cm×20cm)。底部由不銹鋼管組成，可以通過電流。電刺激由程序控制電刺激器產生。實驗環境房間明亮、安靜，訓練箱在每只小鼠訓練前都用75%酒精擦拭干凈，保持空氣干燥，無異味，以免對小鼠產生干擾。適應(第1天)：將小鼠輕輕放入恐懼箱讓其自由探索5min。訓練(第2天)：將小鼠輕輕放入恐懼箱讓其自由探索2min后給予2s，0.6mA的電擊刺激條件刺激，間隔60s后再給予相同足部電擊。最后允許自由探索1min，然后移出訓練箱。測試(第3天)：將小鼠輕輕放入恐懼箱讓其自由探索5min，記錄小鼠在整個過程中僵直不動的時間。僵直時間的比例反映小鼠對場景恐懼記憶的保持能力。

1.2 樹突棘的密度檢測

1.2.1 取材：小鼠于訓練后6h或24h后進行場景恐懼記憶測試，測試后立即常規麻醉處死后快速灌注生理鹽水約120ml，直至血液澄清。之后立即取腦，用手術刀將包含海馬和前額葉的腦組織切成0.5cm厚的組織塊。組織預處理：將組織塊立即轉移浸泡于預先配置好的高爾基固定液中，20ml/2塊組織塊。常溫避光放置2周。2周后轉移到30%蔗糖溶液中(蒸餾水配置)，4℃避光存放48h。

1.2.2 切片：在蒸餾水中使用振動切片機將組織塊緩慢切成150μm的厚切片，盛放在裝滿蒸餾水的六孔板中，在搖床上緩緩搖動，清洗，置于4℃暫時避光保存。

1.2.3 染色：取出切片，將其小心裱片于防脫載玻片上，稍陰干。放在裝有水的避光濕盒中，以保持組織片常濕潤。使用GENMED試劑盒，小心用移液槍滴加Reagent C清理液孵育1min，吸去，以清理組織片上的雜質。小心用移液槍滴加Reagent D染色液孵育30min,用量以覆蓋整個樣本表面為準。小心吸移去切片上的染色液。再次用Reagent C清理液孵育1min, 吸去，以清理組織片上殘留的染色液。再小心用移液槍滴加預先配置好的染色工作液(顯色液A+顯色液B為1∶1配置)孵育10～25min，用量以覆蓋整個樣本表面為準,直至呈現黑色且染出樹突棘，即可終止，過程中可于顯微鏡下觀察染色情況。再次用Reagent C清理液孵育1min，吸去，以清理組織片上的雜質，移去清理液后稍陰干后，用中性樹脂封片。可于顯微鏡下拍照。過程全程避光。

1.3 谷氨酸與谷氨酰胺合成酶酶活的檢測

1.3.1 谷氨酸檢測：收集組織到離心管內，離心后棄上清；稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一進行冰浴勻漿,10 000r/min，常溫離心10min，取上清待測。酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。制備標準溶液：分別稀釋為梯度標準溶液。準備測定：標準管：96 孔板中加入40μl標準溶液、160μl試劑三和10μl試劑四混勻，立即記錄340nm處 20s時的吸光值為A1和5min20s時的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。測定管：在96孔板中加入40μl樣本、160μl試劑三和10μl試劑四混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值為A1和5min20s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。標準曲線的繪制：以谷氨酸含量(μmol/ml)為x軸，標準管ΔA為y軸，繪制標準曲線y=kx+b。將測定管ΔA代入方程得到x值。按照樣品鮮重計算谷氨酸含量(μmol/g 鮮重)=x×V樣本÷(W÷V樣總×V樣本)=x÷W。

1.3.2 谷氨酰胺合成酶酶活檢測:樣本處理：稱取約0.1g組織，加入1ml提取液進行冰浴勻漿。8 000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。測定步驟：酶標儀預熱30min以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。按說明書加入試劑一～三，混勻，靜置10min后，5 000g，常溫離心10min，取200μl上清液至96孔板中，測定540nm處的吸光值A。ΔA=A測定管-A 對照管。酶活計算：按樣本鮮重計算：單位的定義：每克組織在反應體系中每分鐘使 540nm下吸光值變化0.005定義為一個酶活力單位。GS(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷0.01÷T =38×ΔA÷W。V反總：反應體系總體積，400μl=0.4ml；V樣：加入樣本體積，70μl=0.07ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時間，30min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣品質量，g。

2 結果

2.1 海馬區樹突棘的改變 海馬中樹突棘的變化可借助高爾基染色對其進行特異性的組織病理學標記。研究結果顯示24h后檢測恐懼記憶后取海馬腦區再檢測CA1 區的樹突棘改變。場景恐懼訓練任務在24h內顯著增加樹突棘的密度。與對照組相比，PTSD組樹突棘密度有顯著增加。見圖 1(PTSD 組：12.36±2.90，Ctrl 組：9.57±2.97，P<0.05，n=18 dendrites from 4 mice per group)。

圖1 兩組小鼠海馬區樹突棘的密度改變情況

2.2 場景恐懼記憶過程中海馬Glu 的改變 海馬中興奮性神經遞質變化可借助靈敏的試劑盒對海馬區的谷氨酸進行檢測。研究結果顯示24h后檢測恐懼記憶后取海馬腦區再檢測CA1 區的谷氨酸。場景恐懼訓練任務在 24h內顯著增加。與對照組相比，PTSD組谷氨酸有顯著增加。見圖2a(PTSD 組：6 360.87±607.00，Ctrl 組：4 434.08±1 383.55，P<0.05，n=6 per group)。

2.3 場景恐懼記憶過程中海馬GS 的改變 海馬中谷氨酸合成酶可借助靈敏的試劑盒對其進行檢測。研究結果顯示24h后檢測恐懼記憶后取海馬腦區再檢測CA1區的谷氨酸合成酶的酶活性。場景恐懼訓練任務在24h內顯著增加。與對照組相比，PTSD組谷氨酸合成酶的酶活性有顯著增加。見圖2b(PTSD 組：28.67±7.96，Ctrl 組：19.93±1.34，P<0.05，n=6 per group)。

圖2 兩組小鼠海馬區谷氨酸濃度水平和谷氨酰胺合成酶的酶活改變情況

3 討論

本研究結果提示了場景恐懼記憶模型中，海馬區的樹突棘密度相較于正常小鼠有所增加，興奮性神經遞質谷氨酸在海馬區有顯著的提高。并且進一步探查影響谷氨酸的關鍵酶，谷氨酰胺合成酶，表達也有所增加。以上結果提示了在以單純場景的記憶模型中海馬的神經活動增強，形態學和功能學可塑性發生改變，并且可能通過谷氨酸—谷氨酰胺代謝偶聯活動增加來調控記憶的形成，為揭示記憶的形成機制和PTSD 的發病機制上提供了一定的理論依據。

樹突棘密度有所增加，這與既往文獻一致。樹突棘的密度增加提示形態學可塑性增強，形態學的改變提示了存在著新蛋白的合成[6]，而形成這些新的蛋白與突觸之間的神經遞質的不斷補充和神經活動的增強密切相關。谷氨酸的濃度在一定范圍內的提高可以激活谷氨酸能神經元，維持和提高突觸的信息傳遞。谷氨酸濃度的顯著提高有利于增強突觸之間興奮性信息的傳遞[7]。越來越多的證據顯示谷氨酸能神經遞質功能障礙(尤其是NMDA受體功能損害時)會表現出神經退行性癡呆的臨床癥狀和疾病進展。在既往的神經精神疾病的研究中，在AD 病人的腦內研究中有使用非競爭性NMDA受體拮抗劑美金剛增加NMDAR進行治療[7]。新近研究也證實，通過激活谷氨酸能受體可以有效改善AD病人的癥狀。而在場景恐懼記憶為模型的PTSD 疾病研究中，研究其谷氨酸能受體較多，且也有小鼠實驗證據表明谷氨酸能受體激活后，僵直不動的比例得到增加，記憶可得到更好的鞏固和加強。

另一方面，谷氨酸作為腦內最主要的興奮性神經遞質，在突觸前被釋放后主要被星形膠質細胞上的谷氨酸轉運體GLT-1或者GLAST所攝取，之后再由胞內的谷氨酰胺合成酶催化合成谷氨酰胺。合成的谷氨酰胺則被運回突觸前的神經末梢，轉化成谷氨酸或者GABA再次利用，即谷氨酸—谷氨酰胺循環[8]。Glu-Gln 循環被廣泛認為與記憶形成和突觸傳遞有關。這種循環依賴于神經元和星形膠質細胞之間的雙向通訊[9]，其中，僅存在與星形膠質細胞的谷氨酰胺合成酶對谷氨酸的代謝被認為是維持腦內神經遞質谷氨酸和GABA平衡的關鍵[10]。本研究檢測到谷氨酰胺合成酶的酶活性上調，結果提示該代謝偶聯機制得到增強。提示了恐懼記憶的形成過程中可能通過觸發了該潛在機制引起谷氨酸的上調，進而引起記憶的形成。更進一步，作為其唯一表達該酶的細胞—星形膠質細胞，提示了這類原本起支撐、免疫作用的細胞類型在恐懼記憶的形成過程中扮演一定的作用。這與新進研究中對GFAP和記憶之間的研究結果一致[10]。對星形膠質細胞的研究在多種神經精神疾病中發現其具有重要作用。有研究表明星形膠質細胞中的谷氨酰胺合成酶的功能紊亂在癲癇發作的形成和傳播中有重要作用。另也有研究顯示，GS的損傷可能會引起谷氨酸在胞外的大量堆積，擾亂神經遞質的代謝、合成，從而增強癲癇發作易感性[4]。

綜上所述，場景恐懼記憶過程中海馬區發生了形態學和功能學的神經可塑性改變，其中興奮性神經遞質谷氨酸得到顯著上調，可能是由于谷氨酸—谷氨酰胺代謝偶聯的潛在機制導致。而后續研究將進一步探討在PTSD狀態下谷氨酰胺合成酶被活化及其參與恐懼記憶形成的機制。