慢性間歇性低氧對大鼠胸主動脈內皮細胞的影響

侯光宇，溫雯，孫曉靖

1.新疆醫科大學第二附屬醫院心血管內科，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆醫科大學第一附屬醫院高血壓科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學第七附屬醫院重癥醫學科，新疆烏魯木齊 830028

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是由于患者在夜間睡眠過程中頻繁出現的上氣道完全或不完全阻塞而導致呼吸暫停或通氣量減低的睡眠呼吸疾病。隨著對OSAHS 研究的深入，科學家們發現OSAHS 是一種被嚴重低估的慢性疾病。最近的流行病學調查結果顯示，男性中重度OSAHS 的發病率為49.7%，女性為23.4%[1]。睡眠呼吸暫停低通氣指數（apnea-hypopnea index，AHI）是指平均每小時睡眠中的呼吸暫停及低通氣次數，目前診斷OSAHS 的金標準是多導睡眠監測，根據監測的AHI 值可明確診斷并對OSAHS 的嚴重程度進行分級，AHI≥30 次/h為重度，15 次/h≤AHI<30 次/h 為中度，5 次/h≤AHI<15 次/h 為輕度。

在OSAHS 引起的一系列病理變化中，以心血管系統病變最為嚴重，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、缺血性心肌病、心力衰竭、各種類型的心律失常[2-6]。研究顯示，睡眠過程中反復出現的慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是OSAHS 的重要特征之一，并在OSAHS 相關的并發癥中起重要作用[7-8]。CIH 的主要特點是低氧與正常氧交替出現，其炎癥損傷不是發生在去氧飽和階段，而是發生在再氧合階段，是OSAHS 重要的病理機制。本研究通過建立CIH 動物模型，觀察大鼠胸主動脈血管內皮的損傷情況，為OSAHS 的治療及預防并發癥提供一定的理論支持，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

由新疆醫科大學實驗動物中心提供10～12 周齡的雄性SD 大鼠12 只，采用抽簽法將其分為實驗組和對照組，每組各6 只。實驗動物許可證號：SCXK（新）2018-0002。在SPF 級飼養環境中飼養（溫度20～24℃，濕度40%～60%，12h 光-暗循環）。本實驗已通過新疆醫科大學第七附屬醫院倫理委員會審批（倫理審批號：20220427-02）。

1.2 OSAHS 大鼠模型構建

第1 周適應性飼養，第2 周開始每天10 點至18點將實驗組大鼠放在低氧艙內行造模處理，低氧艙內有氮氣和混合性空氣，氧氣濃度處于動態變化，氧氣濃度每個變化周期為4min，周期開始前90s，向艙內充入氮氣，使氧濃度達到6%，90～120s 時將氧濃度維持在6%，120～180s 時將艙內的混合氣體排出，使艙內氧濃度由原來的6%恢復至21%，180～240s 時繼續保持艙內氧濃度為21%，241s 時開始下一周期，如此循環。對照組大鼠不做低氧處理。低氧處理時間時兩組大鼠均在黑暗避光環境下，兩組大鼠的其他生活環境及飲食條件均相同。每天實驗組大鼠低氧處理時間為8h，適應性飼養1 周，間歇性低氧處理4 周，共5 周[9-10]。

1.3 實驗標本取材

兩組大鼠均飼養5 周建模成功后取胸主動脈標本。取標本前，大鼠禁食8h，0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，將其固定于手術臺上，打開胸腔，取出胸主動脈，制作主動脈組織石蠟包埋切片，用于后期組織染色觀察。

1.4 蘇木精-伊紅染色實驗

將大鼠主動脈組織石蠟包埋切片蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）后在光鏡下觀察細胞形態、細胞核及細胞排列情況，并計算病變細胞在視野中所占比例。所需實驗試劑有二甲苯、中性樹膠、無水乙醇、伊紅染液、蘇木素染液等。染色流程：將切片置于65℃恒溫箱中烘烤1h，二甲苯中浸泡脫蠟，無水酒精和蒸餾水中進行水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化后并在自來水中終止分化，在蒸餾水及無水乙醇中脫水，伊紅復染并用二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.5 原位末端轉移酶標記法染色實驗

將大鼠主動脈組織石蠟包埋切片進行原位末端轉移酶標記法（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）染色后在光鏡下觀察凋亡細胞，并計算凋亡細胞在視野中所占比例。所需實驗試劑有TUNEL 凋亡檢測試劑盒-POD、DAB 顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液、3%H2O2、檸檬酸粉劑、無水乙醇、蘇木素染液、二甲苯、中性樹膠。染色流程：將切片在65℃恒溫箱中烘烤1h，二甲苯中浸泡脫蠟，無水酒精和蒸餾水中水化，磷酸鹽緩沖液中行抗原修復，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，切片加標記緩沖液，加入封閉液，抗體稀釋液稀釋生物素化抗地高辛抗體，DAB 顯色試劑盒顯色5～10min，自來水終止染色并用蘇木素染液復染，蒸餾水和酒精中脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理分析。光鏡下所見病變細胞比例及細胞凋亡比例以均數±標準差（±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠主動脈組織HE 染色及TUNEL 染色結果

HE 染色后光鏡下觀察，實驗組視野中可見血管平滑肌細胞核腫脹，血管內皮細胞肥大，排列不規則，細胞核、胞質著色淡；對照組可見血管內皮細胞和平滑肌細胞排列規則、細胞核形態及染色正常，見圖1。TUNEL 染色后光鏡下觀察，實驗組視野中可見多個血管內皮細胞核中有棕黃色顆粒（凋亡細胞）；對照組視野中偶見凋亡細胞，見圖1。

圖1 兩組大鼠主動脈組織染色結果

2.2 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較

實驗組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率均顯著高于對照組（P<0.01），見表1。

表1 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較（±s，%）

表1 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較（±s，%）

3 討論

臨床上根據OSAHS 患者夜間最低血氧飽和度（oxygen saturation，SaO2）水平將缺氧程度分為三度：輕度，SaO2≥85%；中度，80%≤SaO2<85%；重度，SaO2<80%。嚴重的OSAHS 呼吸暫停時間可長達1.5min，SaO2可降至50%以下。低氧艙內氧濃度最低點（6%）時測得大鼠的SaO2在20.9%～29.7%，當氧濃度恢復至21%時，SaO2恢復至92.2%～97.4%，與OSAHS 患者的低氧情況相似，說明本實驗所采用的間歇性低氧艙可較好地模擬CIH 狀態，保證實驗的準確性。

OSAHS 患者反復發生低通氣和呼吸暫停，隨著時間積累，可導致多個器官和系統的病理改變。CIH引起的氧化應激反應使體內產生大量氧自由基，可直接損傷血管內皮，導致血管壁異常增生；CIH可反復刺激外周及中樞化學感受器，使交感神經興奮性增高并激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統，兒茶酚胺釋放增加，腎素及醛固酮分泌增加，水和鈉離子重吸收增強，血管緊張性、心輸出量增加，心肌收縮力增強；CIH 還可誘導釋放一系列炎癥因子，如內皮素1，降低一氧化氮利用率，增加血管及組織損傷。此外，白細胞介素（interleukin）-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α 等也被證實與血管內皮病變相關[11-12]。以上多種因素的共同作用，使動脈血壓升高，心臟后負荷增加、心輸出量減少，對心血管系統有負面影響[13]。患者夜間反復出現間歇性低氧可增加氧化應激及激活炎癥系統，損傷內皮修復功能，增加冠心病發生風險[14]。

既往研究發現，參與OSAHS 的多種因素均可導致心血管系統并發癥，但CIH 導致的動脈內皮細胞凋亡在其并發癥中起關鍵作用，CIH 通過內質網應激誘導主動脈內皮細胞的凋亡[15]，但CIH 引起內質網應激的具體機制尚不清楚。CIH 可引起氧化應激和一系列的慢性炎癥反應，導致血管內皮功能受損，是動脈血管內皮細胞病變的重要危險因素。

本實驗通過建立OSAHS 的慢性間歇性缺氧模型，模擬人體CIH 狀態，建模成功后通過HE 染色及TUNEL 染色在光鏡下觀察主動脈血管內皮病變情況，結果實驗組大鼠的動脈血管內皮細胞水腫明顯，細胞排列不規則，細胞核及胞質染色淡且細胞凋亡明顯，說明實驗組血管病變較對照組嚴重。阻斷慢性間歇性缺氧狀態，對治療OSAHS 及預防OSAHS 并發癥的發生具有重要意義。研究顯示，持續氣道正壓通氣對改善OSAHS 患者夜間間歇性缺氧狀態、預防心血管系統并發癥具有確切的療效[16]。由于動物模型并不能完全模擬人類OSAHS 的全部病理生理特征，實驗可能存在誤差，今后還需要結合大量的臨床病例研究，才能更好地闡明OSAHS 相關的病理生理機制，為OSAHS 患者的治療提供理論依據。

OSAHS 患者由于夜間反復出現呼吸暫停事件，使間歇性缺氧不斷發生，這種缺氧模式是OSAHS 的主要病理機制，也是與各種并發癥發生聯系的樞紐和中心環節，因此改善間歇性缺氧對控制OSAHS 病情、減少并發癥及改善預后具有十分重要的意義。