基于網絡藥理學探討清心滋腎湯治療圍絕經期綜合征的作用機制

郭倩, 張秦, 管群

圍絕經期綜合征（MPS）是指婦女在絕經前后出現以自主神經系統功能紊亂為主、伴有低雌激素癥狀的一組證候群[1］。中醫學將本病歸屬于“絕經前后諸證”“經斷前后諸證”等范疇。國醫大師夏桂成教授提出本病的病因病機以腎陰虛為本、心肝火旺為標, 主張以清心滋（肝）腎、燮理陰陽為治療大法[2］, 故創立名方清心滋腎湯。清心滋腎湯問世至今, 幾經化裁, 治療MPS驗效頗豐[3］。方中鉤藤清心除煩、平肝安神, 蓮子心清心除煩安神, 黃連有清熱瀉火、燥濕解毒之效, 淮山藥有補脾養胃、生津益肺、補腎澀精之功, 山茱萸能滋補肝腎、止汗, 太子參有益氣健脾、生津潤肺之效, 茯苓有健脾寧心、利水滲濕之能, 熟地能滋陰養血、益精充髓。諸藥合用, 使得心腎相交、水火既濟、臟腑平秘。但尚未有關于其藥理作用的研究, 對于清心滋腎湯治療MPS的有效成分、作用靶點和機制仍不是十分明確。

網絡藥理學是運用數據庫檢索、計算機模擬以及數據分析等方法, 構建藥物成分-靶點-疾病的調控網絡, 為中醫藥治療疾病提供理論支撐[4］。本研究于2021年1—6月運用網絡藥理學探討清心滋腎湯治療MPS的作用機制, 以及可能的信號通路, 以期為臨床實踐提供理論依據以及動物實驗提供方向。

1 資料與方法

1.1 清心滋腎湯藥物活性成分及靶點的收集和篩選通過檢索TCMSP數據庫, 以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18作為篩選條件, 對清心滋腎湯中8味中藥（鉤藤、蓮子心、黃連、淮山藥、山茱萸、太子參、茯苓、熟地）的活性成分和靶點進行檢索。再將活性成分對應的靶點基因導入蛋白質數據庫Uniprot, 限定物種為人（Homo sapiens）, 并對每個靶點對應的基因進行校正, 從而獲得標準化的名稱Gene Symbol, 簡稱Symbol。

1.2 MPS疾病靶點的預測將“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”作為檢索詞, 通過檢索基因名片數據庫GeneCards、人類孟德爾遺傳數據庫OMIM、治療靶點數據庫TTD、藥物基因組學知識庫PharmGkb、DrugBank等疾病相關數據庫, 去除重復的靶點后取并集, 獲得疾病靶點基因。

1.3 清心滋腎湯對MPS作用靶點的預測運用Venn R對MPS疾病基因與清心滋腎湯藥物共同靶點進行對比分析, 將MPS與中藥活性成分對應的靶點基因取交集, 將交集靶點作為構建中藥復方調控網絡的橋梁。

1.4 構建清心滋腎湯“活性成分-靶點”中藥復方調控網絡將藥物活性成分、MPS靶點基因、交集靶點基因導入Cytoscape 3.8.0中, 構建清心滋腎湯“活性成分-靶點”復方調控網絡。

1.5 構建交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡運用String數據庫進行PPI分析, 導入中藥活性成分對應的靶點基因與疾病靶點基因的交集, 設置蛋白種類為“Homo sapiens”, 設置相互作用閾值為“medium confidence”（0.4）, 去除游離節點, 建立PPI網絡。

1.6 基因本體論（GO）與京都基因和基因組數據庫（KEGG）富集分析將基因Symbol轉化為基因ID, 通過R軟件進行GO和KEGG通路富集分析, 繪制氣泡圖及相關信號通路圖。

2 結果

2.1 篩選清心滋腎湯有效活性成分通過TCMSP數據庫檢索出清心滋腎湯中包含的藥物, 經OB、DL值篩選出可被口服吸收的119個活性成分, 刪除無作用及重復靶點, 獲得93個有效活性成分, 如表1。

表1 清心滋腎湯中藥活性成分

2.2 篩選MPS疾病基因以“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”為檢索詞在 Gene-Cards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank數據庫中進行查找, 最終在GeneCards、PharmGkb、DrugBank檢索到相應內容, 將3個數據庫檢索到的基因取并集、去重復, 共得到451個MPS的基因靶點。

2.3 “藥物靶點-疾病基因”交集作用靶點的預測運用R x64 4.1.1對清心滋腎湯中有效活性成分對應的基因靶點和MPS疾病靶點進行Venn分析, 獲得 54個顯效靶點基因交集, 主要有SCN5A、雌激素受體-1（ESR1）、OPRM1、AR、ADRA1B、ADRA1D、MAPK1、CDKN1A、血紅素加氧酶1（HMOX1）、孕激素受體（PGR）、CYP3A4等靶點。

2.4 構建“活性成分-靶點基因”調控網絡基于Cytoscape構建清心滋腎湯各藥物活性成分與MPS疾病靶點的網絡圖, 如圖1。其中度值（Degree）越高, 表示其在調控網絡中的作用越強。圖1是由54個潛在靶點基因和69個活性成分組成的調控網絡。由于每個潛在的靶點基因都與多個活性成分之間存在聯系, 可以推測清心滋腎湯治療MPS可能是多靶點、多途徑的。

圖1 清心滋腎湯治療圍絕經期綜合征“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網絡圖

2.5 清心滋腎湯與MPS交集基因PPI網絡的構建將“2.3”中得到的54個交集基因導入String數據庫, 設置物種為Homo sapiens, medium confidence設置為0.400, 去除游離節點, 構建PPI網絡圖, 如圖2。該圖由54個節點（Node）、350條邊（Edge）構成, 平均節點度值為13。

圖2 清心滋腎湯治療圍絕經期綜合征交集靶點的蛋白互作網絡（PPI）圖

將構建的PPI網絡圖以tsv的形式導入Cytoscape 3.8.0, 運用CytoNCA對節點進行BC（betweenness centralities）、CC（closeness centralities）、DC（degree centralities）、EC（eigenvector centralities）、LAC（local average connectivity-based centralities）、NC（network centralities）數值再計算一次, 選取數值大于中位值的節點構建PPI核心, 該核心由12個節點、74條邊構成, 根據度值由大到小依次為：白細胞介素（IL）-6（度值80）、IL-1β（度值64）、ESR1（度值54）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）（度值52）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）（度值52）、補體調節蛋白（CRP）（度值42）、細胞周期蛋白D1（CCND1）（度值40）、PGR（度值38）、HMOX1（度值38）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）（度值36）、胰島素樣生長因子結合蛋白3（IGFBP3）（度值32）、細胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）（度值30）, 以上

基因被認為是治療MPS的核心靶點。

續表1 清心滋腎湯中藥活性成分

2.6 GO富集分析運用R軟件將基因Symbol轉換為基因ID。對“2.5”中獲得的核心靶點基因進行 GO 富集分析, 共獲得P＜0.05的GO功能條目1 280條, 其中生物過程（BP）1 180條, 細胞組分（CC）39條, 分子功能（MF）61條。其中生物過程、細胞組分、分子功能富集基因數排序前31位的GO分析結果繪制氣泡圖, 如圖3。生物過程主要富集在對藥物的反應、多細胞生物過程、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應等生物反應。細胞組分主要富集在細胞膜筏、細胞膜微結構域、細胞膜小窩、血漿細胞膜筏等細胞部位。分子功能主要富集在核受體活動、配體激活、轉錄因子活動、G蛋白偶聯受體活性等。如圖3所示, 可以推測清心滋腎湯是通過調節多個GO功能來發揮治療作用的。

圖3 清心滋腎湯治療圍絕經期綜合征GO富集氣泡圖

2.7 KEGG通路富集分析通過KEGG通路富集分析共獲得162條信號通路, 找到與MPS相關信號通路Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）繪制通路圖, 如圖4。篩選出前30條信號通路, 繪制氣泡圖, 如圖5。根據氣泡圖可以看出主要涉及的信號通路有糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、化學致癌作用受體激活通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、乳腺癌通路、細胞衰老通路等。由此可見, 清心滋腎湯通過協同作用于多條信號通路來治療MPS。選取相關性最大的AGE-RAGE信號通路繪制通路圖, 如圖6。

圖4 清心滋腎湯Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）潛在靶基因KEGG分析圖

圖5 清心滋腎湯治療圍絕經期綜合征KEGG信號通路氣泡圖

圖6 清心滋腎湯AGE-RAGE信號通路潛在靶基因KEGG分析圖

3 討論

由圖1可以發現, 清心滋腎湯中起作用的主要活性成分共69個, 其中度值較高的活性成分有木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氫鴨腳木堿等, 提示這些活性成分在改善圍絕經期癥狀中發揮重要作用, 推測其可能是清心滋腎湯治療MPS的有效成分。木樨草素是天然黃酮類化合物中的代表性成分, 具有抗炎、抗氧化、降血壓和舒張血管、抗動脈硬化等藥理學作用[5］。山柰酚亦為黃酮類化合物, 研究顯示, 山柰酚和木樨草素具有抗脂代謝紊亂和抗細胞凋亡的功效, 從而起到保護缺血心肌的作用[6］。此外, 山柰酚可通過上調骨骼肌P13KAKT-GLUT4信號通路, 改善糖尿病小鼠胰島素抵抗[7］。由此可見, 山柰酚和木樨草素可以改善圍絕經期女性糖脂代謝紊亂的狀態, 降低心血管病的發生風險。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂、促進顆粒細胞增殖改善卵巢功能等作用[8］, 即通過改善卵巢功能, 提高雌激素水平從而降低MPS遠期并發癥發生的風險。豆甾醇和谷固醇分別作為植物甾醇和植物固醇, 具有抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇、調節體內激素和調節代謝的作用[9-10］。四氫鴨腳木堿是從雞骨常山中提取的生物堿類化合物, 具有抗高血壓、抗糖尿病、抗菌等作用[11］。故清心滋腎湯有效成分對高血壓、糖尿病、高脂血癥、動脈粥樣硬化、氧化應激等圍絕經期易出現的疾病均具有一定的干預作用。

通 過 構 建PPI核 心 得 到IL-6、IL-1β、ESR1、PPARG、PGR、CYP19A1等12個與MPS關系較為密切的靶點基因。圍絕經期病人由于雌激素水平明顯下降, 雌激素受體亦隨之下降, 導致免疫細胞不能產生足夠量的IL-6、IL-1β等免疫介質, 與去甲腎上腺素的比例失調, 最終導致MPS臨床癥狀的發生[12］。ESR1表達水平和雌激素的生物學效應相關, ESR1基因中XbaI位和PvuI位多態性與早發性卵巢功能不全（POI）的發生存在相關性[13］。研究發現PGR信號傳導是卵母細胞排卵所必須的, PGR缺失小鼠無法排卵[14］。PPARG基因在調節胰島素敏感性、脂肪細胞特異基因表達方面有突出的作用, 可能與糖尿病、代謝綜合征的發生密切相關[15］。絕經后使用芳香化酶抑制劑的乳腺癌病人的血脂水平與CYP19A1的單核苷酸多態性有關[16］。此外, 本研究 中 還 發 現CCND1、CRP、SERPINE1、HMOX1、VCAM-1、IGFBP3等基因也與MPS密切相關。

基于KEGG通路富集分析可以看出清心滋腎湯治療MPS的潛在信號通路包括糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路等。研究顯示AGE-RAGE系統在炎癥反應、細胞損傷等方面均有促進作用, 參與心血管疾病、代謝綜合征、2型糖尿病、卵巢功能障礙等多種疾病的發生[17］。前期研究已經證實清心滋腎湯能在一定程度上調節絕經綜合征所引起的脂質紊亂狀態, 主要通過調節脂質代謝發揮作用[18］, 推測與脂質和動脈粥樣硬化信號通路有關。研究發現雌激素能增加一氧化氮（NO）的釋放, 降低內皮素的產生, 而流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路可通過調控NO的釋放, 影響內皮細胞的功能及血管通透性的改變, 促進脂質蓄積[19］, 故圍絕經期女性由于卵巢功能的衰退, 雌激素水平下降, 易出現高血壓、代謝性疾病等。隨著生活質量的提高, 對于圍絕經期婦女心血管疾病的預防和治療引起了廣泛關注。PI3K-Akt信號通路是調控細胞生存、生長和增殖的經典通路, 王君實等[20］研究發現亞麻木酚素的主要活性成分SDG可通過增加血清雌二醇水平激活ESR1, 從而激活PI3K-Akt-eNOS信號通路, 對去卵巢大鼠的心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

綜上所述, 清心滋腎湯治療MPS可能是通過木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氫鴨腳木堿等有效成分作用于IL-6、IL-1β、ESR1、SERPINE1、PPARG、CRP、CCND1、PGR、HMOX1、VCAM-1、CYP19A1、IGFBP3等關鍵靶點通過調節糖脂代謝、抗氧化、改善雌激素代謝等作用機制達到治療MPS的作用。