維吾爾族成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜毎籽。┕撬枘I母細胞瘤基因1和轉錄因子ETS-1表達與預后的關系

阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼, 姑麗斯坦·阿不都熱西提, 阿斯亞·麥麥吐遜, 努爾比亞·阿布都熱西提

急性髓系白血?。ˋML）是一類高度異質性疾病, 以髓系原始細胞增高為主要特征, 大多數AML病人病情急重, 預后兇險, 如不及時治療可危及生命[1-3］。腎母細胞瘤基因1（WT1）在生理及病理性造血過程中承擔著重要角色, 其表達水平與多種惡性血液疾病的發生、發展、治療密切相關, WT1基因在絕大部分AML病人中均表現為異常高表達, 其過度表達可作為“泛白血病”的分子標志物, 具有十分重要的意義[4-7］。轉錄因子ETS-1屬于ETS轉錄因子家族成員之一, 其在細胞增殖、分化及組織重構等多種生物學過程中發揮著重要作用, 能夠調節尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物, 基質金屬蛋白酶等一系列與細胞外基質重建有關的基因表達, 從而使細胞黏著性降低, 有利于腫瘤的浸潤生長和轉移[8-10］。目前, 國內外對于轉錄因子ETS-1在維吾爾族成人新發AML（非M3）病人中的表達水平變化情況及意義的研究尚未見報道, 故本研究通過檢測WT1和ETS-1基因的表達水平, 旨在探討二者在AML（非M3）發生發展、療效評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年6月至2018年10月喀什地區第一人民醫院血液科收住的105例維吾爾族初診AML（非M3）病人為觀察組, 男60例, 女45例, 年齡（40.12±5.38）歲。選取同期于該院100例健康體檢者為對照組A, 及在該院治療的100例漢族初診AML（非M3）病人為對照組B。對照組A男61例, 女39例, 年齡（39.55±5.45）歲；對照組B男60例, 女40例, 年齡（39.74±5.62）歲。三組研究對象一般資料比較, 詳見下文“2.1”結果部分。

樣本量計算：利用PASS 15軟件, 設α=0.05, 把握度（power）=90%,OR=2, 雙側檢驗, 計算得到樣本量N1=N2=67例, 考慮可能有失訪人數, 按20%算,N1、N2至少需要80例。因此, 本研究納入105例維吾爾族初診AML（非M3）病人為觀察組, 100例健康體檢者為對照組A、100例漢族初診AML（非M3）病人為對照組B。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入與排除標準納入標準：（1）病人均為初診者, 經血常規、免疫分型及臨床癥狀等綜合診斷, 符合《血液病診斷及療效標準》[11］相關診斷標準且參照FAB分型標準；（2）病人均已成人；（3）所有研究對象及其近親屬知情同意, 并簽署知情同意書。排除標準：（1）慢性粒細胞白血病；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并嚴重感染；（4）入組前已接受相關治療者；（5）臨床資料不完整者。

1.3 治療方法AML（非M3）治療方法參照2011年版《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細胞白血?。┲袊\療指南（2011年版）》[12］。根據病人年齡及體質等具體情況接受相關誘導治療, 并在治療過程中檢測骨髓恢復情況對方案進行相應調整。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 主要試劑與儀器 Real MasterMix試劑, 購自天根生化科技有限公司；日立超高速冷凍離心機, 購自美國Thermo MicroMax公司；多功能酶標儀, 購自上海首立實業有限公司。低溫高速離心機, 購自美國Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒、TaKaRa逆轉錄試劑盒, 購自美國InvitRogen公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀, 購自美國Bio-Rad公司；分光光度計, 購自上海舜宇恒科儀器有限公司；引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成等。

1.4.2 WT1和ETS-1 mRNA表達水平檢測 無菌條件下常規抽取對照組及AML（非M3）病人骨髓1～2 mL, 乙二胺四乙酸抗凝, -80 ℃凍存, 以qRT-PCR法檢測骨髓中WT1和ETS-1表達水平。以TRizol RNA提取試劑盒提取樣本總RNA, 紫外分光光度法鑒定各樣本提取的RNA純度和完整性。按照逆轉錄試劑盒說明書將血清RNA逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。WT1正向引物：5＇-ATGGAGAAGGGTTACAGCAC-3＇, 反向引物：5＇-ATGCTTGAATGAGTGGTTGG -3＇；內參ABL正向引物：5＇-AAGCTGGTGGGCTGCAAATC-3＇, 反 向 引 物：5＇-GTTCCAACGAGCGGCTTCA-3＇。ETS-1正向引物：5'-TGATGTGGGCTGTGAATGAG-3', 反向引物：5'-TGAAGTAATCCGAGGTGTAACG-3'；內參GAPDH正向引物：5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3', 反 向 引 物：5'-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'。引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系20 μL：2.5×Real MasterMix 8 μL；正反向引物各0.4 μL；熒光探針0.8 μL；MGB Taqman探針10 μL；cDNA樣本2 μL；加雙蒸水至20 μL。選擇qPCR反應程序上機, 共40個PCR循環, qPCR擴增條件：42 ℃, 30 min；94 ℃, 5 min；94 ℃, 45 s；60 ℃, 80 s。以2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.5 統計學方法運用統計學軟件SPSS 20.0對數據進行處理。計數資料以例（%）表示, 比較采用χ2檢驗；符合正態分布計量資料以±s表示, 三組間比較行單因素方差分析, 差異有統計學意義時兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布計量資料采用中位數（第25、第75百分位數）[M（P25,P75）］表示, 組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；多因素logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素；并采用Kaplan-Meier方法描述生存曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較觀察組與對照組年齡及性別比較, 差異無統計學意義（P＞0.05）。觀察組和對照組B白細胞計數明顯高于對照組A, 血小板計數及血紅蛋白明顯低于對照組A, 均差異有統計學意義（均P＜0.05）；觀察組和對照組B病人白細胞計數、血小板計數及血紅蛋白比較, 差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2 三組骨髓WT1、ETS-1表達水平比較三組骨髓WT1和ETS-1表達水平相比, 差異有統計學意義（P＜0.05）。觀察組和對照組B骨髓WT1和ETS-1表達水平明顯高于對照組A（P＜0.05）, 觀察組病人骨髓WT1、ETS-1表達水平明顯高于對照組B（P＜0.05）。見表2。

表2 三組骨髓WT1、ETS-1表達水平比較

2.3 logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素將是否發生AML作為因變量（否=0, 是=1）, 將白細胞計數、血小板計數、血紅蛋白、WT1、ETS-1（均為連續變量）作為自變量納入模型。logistic回歸分析顯示, WT1、ETS-1均是AML（非M3）的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 logistic回歸分析AML（非M3）的影響因素

2.4 骨髓WT1和ETS-1與病人預后關系105例AML（非M3）病人均完成1療程的誘導治療, 1療程后完全緩解67.62%（71/105）, 部分緩解22.86%（24/105）, 未緩解9.52%（10/105）。對病人進行為期3年的隨訪, 期間有31例病人死亡（完全緩解2例, 部分緩解19例, 未緩解10例）, 20例病人隨訪期間疾病進展, 3年無進展生存率為51.43%（54/105）。

以AML（非M3）病人WT1、ETS-1中位數為界, 以WT1值＞0.71為WT1高表達組（48例）, 以ETS-1值＞0.92為ETS-1高表達組（57例）。采用Kaplan-Meier分析顯示, WT1低表達組3年無進展生存率（68.42%）明顯高于高表達組（31.25%）（χ2=4.80,P=0.028）, ETS-1低表達組3年無進展生存率（75.00%）明顯高于高表達組（31.58%）（χ2=6.56,P=0.010）。見圖1。

圖1 維吾爾族成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜毎籽。?05例骨髓腎母細胞瘤基因1（WT1）和轉錄因子ETS-1表達的生存曲線：A為WT1；B為ETS-1

3 討論

AML是髓系造血干細胞惡性疾病, 以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細胞異常增生為主要特征, 目前認為白血病的發生、發展與多種相關基因的表達失?；颍ê停┮职┗蚴Щ钣嘘P, 可能是遺傳學和環境因素共同作用的結果, 臨床表現為貧血、出血、感染和發熱及代謝異常等, 多數病人病情急重, 如不及時治療常可危及生命[13-14］。AML的治療難度大且易復發, 其治療以化療和造血干細胞移植為主要手段, 與化療相比, 造血干細胞移植可有效地提高生存率, 并且在一定程度上有可能根治白血病[15-16］。

WT1最初是從腎母細胞瘤細胞中分離出來的, 是抑癌基因也是一種癌基因, 可與多種造血調控因子相互作用, 具有增強或抑制目的基因轉錄的作用, 調控造血細胞的增殖、凋亡以及分化[17-18］。WT1在白血病的發病機制中起著癌基因的作用, 可導致細胞分化障礙, 誘導耐藥, 抑制凋亡, 在絕大多數AML病人的外周血或骨髓中存在高表達, 但在正常人群中微量表達, 且AML病人WT1 SNP rs16754不同基因型在性別分布上存在差異, 對AML其他臨床特征沒有影響[9］。AML過度表達可作為“泛白血病”的分子標志, 臨床上, 其表達情況可用于判斷病人是否需要造血干細胞移植及微小殘留病灶（MRD）的療效, 而MDR1基因與白血病的多藥耐藥現象相關, AML病人MDR1和WT1表達水平存在相關性[6］。竇翠云等[19］研究指出, WT1基因在AML病人的表達水平明顯高于正常骨髓, 與此研究結果相似, 本研究中, 觀察組骨髓WT1表達水平明顯高于對照組A和對照組B, 提示WT1基因可能參與AML（非M3）的發生及發展進程, 在維吾爾族AML（非M3）病人中同樣表現為明顯的升高。

ETS-1是從鳥類白血病病毒E26中提取出來的原癌基因c-ETS-1的表達產物, 發揮著轉錄調節作用, 故稱轉錄調節因子, 是ETS家族具有代表性的轉錄調控因子, 也是其發現最早研究最多的成員之一。ETS-1主要是通過調節一些與基質降解有關酶類等基因的表達來參與組織重構過程, 是介導組織纖維化的重要轉錄因子, 在淋巴細胞發育、血管形成、炎癥、腫瘤的生長和侵襲轉移等方面具有重要作用, 相關研究表明, ETS-1是血管形成過程中必需的調節因子, 在乳腺癌等多種腫瘤疾病中表現為高表達, 并證實其有促進血管形成作用, 參與腫瘤的浸潤和轉移過程[12, 20］。本研究結果顯示, 觀察組病人ETS-1表達水平明顯高于對照組A和對照組B, 表明ETS-1可能在AML（非M3）的發生發展中起著一定作用。本研究結果還顯示, 維吾爾族骨髓WT1、ETS-1表達水平高于漢族病人, 提示骨髓WT1、ETS-1表達可能存在一定的民族差異性, 導致民族差異的原因可能是由于不同群體有各自不同的優勢等位基因從而造成遺傳學上存在一定的差異, 但由于WT1、ETS-1在AML中的研究較少, 其在不同種族之間的表達仍需更多的研究驗證。logistic回歸分析顯示, WT1、ETS-1均是影響AML發生危險因素, 提示兩者可能也存在調控作用, 參與AML的發生、發展過程, 臨床檢測應該對兩者給予一定重視。另應用K-M分析顯示, WT1、ETS-1低表達組生存率高于高表達組, 說明WT1、ETS-1異常高表達可能與病人預后有關, 提示兩者可能作為評估預后生物標志物。

綜上所述, 維吾爾族成人AML（非M3）病人骨髓WT1和ETS-1水平呈高表達, 二者與疾病的發生發展密切相關, 可能作為臨床治療和療效評估的參考指標。但由于本研究選取時間較短, 今后還需擴大樣本容量, 深入探討WT1和ETS-1的相互關系及其參與AML（非M3）的具體調控機制。