不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性成分的差異研究

屠曉航，李鵬鵬，卞 歡，耿志明，諸永志，徐為民,3,，王道營(yíng),3,

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類[1]。克氏原螯蝦營(yíng)養(yǎng)豐富，膽固醇含量低，富含賴氨酸、谷氨酸、丙氨酸等多種氨基酸，以及平衡的脂肪酸組成和多種揮發(fā)性物質(zhì)[2-3]。截至2022年，我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積達(dá)1.87 km2、產(chǎn)量289.07 萬t，同比分別增長(zhǎng)7.69%和9.76%，養(yǎng)殖產(chǎn)量首次超過鯽魚和鯉魚，產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值達(dá)到4 580 億元[4]。揮發(fā)性物質(zhì)能客觀地反映食品的風(fēng)味特點(diǎn)，是評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是被消費(fèi)者接受的主要因素之一[5]。國內(nèi)外對(duì)克氏原螯蝦的研究主要集中在養(yǎng)殖模式、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、副產(chǎn)物利用[6]等方面，但對(duì)于其揮發(fā)性成分，尤其是不同養(yǎng)殖模式蝦肉中揮發(fā)性成分的報(bào)道較少。徐文思等[7]在小龍蝦水煮液中共檢出73 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類、烴類、酯類等，這些物質(zhì)對(duì)小龍蝦水煮液風(fēng)味起重要作用。Lee等[8]采用氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術(shù)在熟制美洲龍蝦尾肉中檢出47 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，2-甲基丁醛、3-辛烯-2-酮、1-(甲硫基)丙醛等8 種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)美洲龍蝦的風(fēng)味做出的貢獻(xiàn)較大。何珊等[9]在研究新鮮南、北方地區(qū)中華絨螯蟹中揮發(fā)性物質(zhì)的差異時(shí)，均檢出醇類、醛類和碳?xì)漕惖葥]發(fā)性物質(zhì)，其中乙酸乙酯、1-戊烯-3-醇等物質(zhì)差異可能是造成兩地中華絨螯蟹風(fēng)味不同的原因。目前，對(duì)克氏原螯蝦的揮發(fā)性風(fēng)味成分品質(zhì)的分析報(bào)道較少，共養(yǎng)模式對(duì)克氏原螯蝦風(fēng)味品質(zhì)的影響機(jī)制也有待研究。

克氏原螯蝦的養(yǎng)殖模式多樣，主要有稻田養(yǎng)殖、蟹塘養(yǎng)殖、藕塘養(yǎng)殖、池塘主養(yǎng)，其他還有茭白田、泥鰍池、水泥池、大棚精養(yǎng)等養(yǎng)殖模式，稻田養(yǎng)殖是其中的主要模式[10-11]。Xu Qiang等[12]采用生命周期評(píng)價(jià)方法評(píng)估了3 種養(yǎng)殖模式（即單一水稻栽培、蝦單一養(yǎng)殖和稻蝦共養(yǎng)）對(duì)環(huán)境影響，研究認(rèn)為稻蝦共養(yǎng)模式可以更低的環(huán)境成本提供更多的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)還能提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。蟹蝦、藕蝦養(yǎng)殖模式充分利用河蟹第3次蛻殼到第4次蛻殼之間和蓮藕葉莖出水后到藕收獲之間的間歇開展養(yǎng)殖，在保證主養(yǎng)品種河蟹、藕產(chǎn)量基本不變的前提下，可多收獲一定量的小龍蝦，從而提高總經(jīng)濟(jì)效益[13]。由于地理位置、養(yǎng)殖模式、生產(chǎn)方式等不同，食品中揮發(fā)性物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可能存在差異，如Kalogiouri等[14]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)結(jié)合層次聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA），利用稀疏偏最小二乘判別分析建立穩(wěn)健的分類模型，成功區(qū)分常規(guī)和有機(jī)養(yǎng)殖核桃油。因此，研究不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉的揮發(fā)性成分，不僅可以為養(yǎng)殖戶對(duì)克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式的選擇提供一定參考，也可以為消費(fèi)者對(duì)克氏原螯蝦的選擇提供思路。本研究采用HS-SPME-GC-MS對(duì)4 種養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析，并采用PCA和聚類分析法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，探討不同養(yǎng)殖模式之間克氏原螯蝦肉揮發(fā)性風(fēng)味成分差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦于2022年8月18日在江蘇省興化市取樣，不同養(yǎng)殖模式各選取10 尾（25.00±5.00）g鮮活克氏原螯蝦，去殼、取肉后用液氮速凍并于-80 ℃冰箱內(nèi)貯藏。1 周內(nèi)完成不同貯藏模式克氏原螯蝦HS-SPME-GC-MS檢測(cè)和分析，樣品信息見表1。

表1 不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦樣品信息Table 1 Information on Procambarus clarkiisamples from different culture modes

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭） 美國Supelco公司；TSQ8000EVO GC-MS儀美國Thermo Fisher公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；頂空采樣瓶 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品處理：取出樣品在4 ℃條件解凍，分別稱取3.00 g克氏原螯蝦肉于頂空瓶中，每種養(yǎng)殖模式蝦肉各取樣3 次，加入10 μL 0.05 μg/μL 2-甲基-3庚酮（內(nèi)標(biāo)物），密封后，用渦旋儀混勻，60 ℃加熱，將肉熟化60 min后，獲取頂空成分。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)

參照韓偉等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。使用前，將萃取頭在GC儀進(jìn)樣口處老化1 h。用固相微萃取頭在58 ℃條件下頂空吸附50 min，然后分析揮發(fā)性化合物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：將Xcalibur工作站與NIST 17質(zhì)譜庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)比，將峰高高于底峰3 倍且匹配度最高的成分作為鑒定結(jié)果。

定量分析：利用NIST譜圖庫自動(dòng)結(jié)合手動(dòng)積分得到的峰面積，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的添加量，求得各揮發(fā)性化合物在克氏原螯蝦肉中含量。

通過SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中的揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行PCA及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍蝦肉中揮發(fā)性成分種類和含量分析

由表2、3可知，6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦中共檢出31 種揮發(fā)性成分，包括8 種酮類、3 種酯類、13 種烴類、3 種胺類、2 種醇類、2 種其他物質(zhì)。DX1、DX2、DX3、XX1、XX2和OX養(yǎng)殖模式分別檢出20、20、19、24、18、21 種。

表2 不同養(yǎng)殖克氏原螯蝦揮發(fā)性成分及含量Table 2 Volatile components and contents of different cultured Procambarus clarkia ng/g

表3 不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦揮發(fā)性成分分類比較Table 3 Comparison of the composition of volatile components of Procambarus clarkii in different culture modes

酮類是食品中一類重要的揮發(fā)性物質(zhì)，通常閾值較低，對(duì)食品的風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)[16]。酮類揮發(fā)物通常來源于脂質(zhì)氧化、烷烴降解和美拉德反應(yīng)[17]。2-壬酮常被認(rèn)為是甲殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中的有利揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有濃郁的果香且閾值較低[18]，可能是克氏原螯蝦肉中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。由表2～3可知，酮類物質(zhì)在6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量都存在顯著差異（P＜0.05），DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中的種類和含量分別為6（17.56 ng/g）、5（14.73 ng/g）、6（16.35 ng/g）、7（17.45 ng/g）、4 種（7.17 ng/g）和8 種（17.66 ng/g）。3-庚酮、4-辛酮、2,4-二甲基-3-庚酮、5-壬酮是6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中的共有揮發(fā)性酮類物質(zhì)，而3,5-二甲基-2-辛酮僅在DX3、XX1、OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中存在，且含量較高，可能是造成不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦風(fēng)味不同的原因。

酯類物質(zhì)通常是由脂肪或蛋白質(zhì)降解引起的醇和酸之間的酯化反應(yīng)產(chǎn)生，或來自乙醇中甘油三酯、脂肪酸和酯之間的醇解反應(yīng)，通常具有花香和果香，可減弱脂肪酸的刺激性氣味和苦味氨基酸的風(fēng)味，酯類化合物閾值較低，通常對(duì)食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大[19-20]。在本研究6 組養(yǎng)殖模式中，除DX2（0.11 ng/g）和DX3（0.05 ng/g）外，DX1、XX1、XX2、OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性物質(zhì)含量相差不大，分別為0.18、0.17、0.19、0.19 ng/g。十六烷酸甲酯是唯一一種在6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中均存在的揮發(fā)性物質(zhì)。

31 種揮發(fā)性化合物中烴類物質(zhì)種類最多，DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性物質(zhì)分別為8、9、8、12、8、7 種，含量分別為15.65、11.80、4.74、10.31、10.54、8.87 ng/g。烴類通常是由脂肪酸烷氧自由基均裂產(chǎn)生，其閾值較高，對(duì)食品風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[21]。烯烴類物質(zhì)通過加成、縮合等反應(yīng)可以形成酮類和醇類，是克氏原螯蝦產(chǎn)生腥味的潛在因素[22]。但王惠惠等[23]認(rèn)為此類物質(zhì)可作為醛類、酮類的前體物質(zhì)，有助于促進(jìn)肉產(chǎn)品風(fēng)味的形成。1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯、十四烷僅在XX1養(yǎng)殖模式中檢測(cè)到，這可能是引起XX1與其他模式克氏原螯蝦肉風(fēng)味不同的原因。除1,1,3,3-四乙氧基丙烷僅在DX3養(yǎng)殖模式檢測(cè)到外，其他烴類物質(zhì)的種類差異較小，僅在含量方面表現(xiàn)較大差異。

醇類物質(zhì)主要來源于脂肪氧化、氨基酸還原和碳水化合物的代謝[24]。部分醇類具有花香和果香，主要由相應(yīng)醛的還原產(chǎn)生，僅在含量高時(shí)才被感知，對(duì)食品風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[25]。朱青云等[26]研究青海牦牛肉的揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)時(shí)，認(rèn)為醇類閾值較高，對(duì)青海牦牛肉的揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)貢獻(xiàn)不大。除DX2養(yǎng)殖模式，醇類在其余5 種養(yǎng)殖模式小龍蝦肉中的揮發(fā)性物質(zhì)含量差異不顯著，且僅在DX2養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中檢出2 種醇類化合物，其含量為2.33 ng/g；DX1、DX3、XX1、XX2養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中均含有1 種揮發(fā)性物質(zhì)，而OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中未檢出醇類物質(zhì)。

檢出的揮發(fā)性化合物中胺類物質(zhì)占比較小，總量為0.56～0.88 ng/g。6 組養(yǎng)殖模式中除OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦外（3 種），其他養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中都含有2 種胺類物質(zhì)。

2.2 確定主成分

主成分碎石圖曲線的陡峭程度可以反映各成分的變化趨勢(shì)，進(jìn)而明確主成分的提取數(shù)量[27]。一般來說，高質(zhì)量PCA模型中前2 個(gè)PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率應(yīng)在60%以上[28]。由圖1可知，前3 個(gè)PC的特征值呈快速下降趨勢(shì)，且從第4個(gè)PC特征值開始，碎石圖曲線趨于平緩。由表4可知，3 個(gè)PC的特征值分別為14.81、7.17、2.98，均大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率為96.01%，能夠準(zhǔn)確反映6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉揮發(fā)性風(fēng)味的整體狀況。因此，選取前3 個(gè)P C 作為本研究中6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性成分評(píng)價(jià)的分析指標(biāo)。

表4 不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦主成分結(jié)果Table 4 Eigenvalues and contribution rates of principal components for Procambarus clarkii in different culture modes

2.3 不同養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉揮發(fā)性成分的PCA差異

PCA作為一種多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)被廣泛用于樣本變異分析，能夠簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)并揭示不同樣本之間的相互關(guān)系，這種分析涉及描述樣本之間的無監(jiān)督分類趨勢(shì)[29-30]。PCA首先對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)而便于對(duì)6 組樣品間的相似性和差異性進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。Gewers[31]、羅楊[32]等認(rèn)為PCA中樣品之間距離近則代表差異小，距離遠(yuǎn)則代表差異明顯。如圖2所示，各組樣品均被分開且無任何重疊，表明各組樣品在揮發(fā)性成分上皆存在差異，通過PCA分析，6 組養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中的揮發(fā)性成分得到較好的區(qū)分，且重復(fù)性較好。

圖2 不同養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉揮發(fā)性成分的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot of volatile components of Procambarus clarkii meat from different farming modes

2.4 不同養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性成分的綜合評(píng)價(jià)

以3 個(gè)PC為初始自變量，經(jīng)PCA計(jì)算因子得分，再根據(jù)因子得分系數(shù)矩陣和每個(gè)PC的特征值得出克氏原螯蝦肉中揮發(fā)性成分前3 個(gè)PC線性關(guān)系分別為：

式中：X1～X31代表不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中所檢出的31 種揮發(fā)性成分。

根據(jù)所提取PC對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，對(duì)3 個(gè)PC得分進(jìn)行權(quán)重加和，建立綜合評(píng)價(jià)函數(shù)F＝0.569F1+0.278F2+0.115F3，計(jì)算各組綜合得分，分值越高表明克氏原螯蝦的揮發(fā)性風(fēng)味成分品質(zhì)越好。如表5所示，6 組養(yǎng)殖模克氏原螯蝦肉中DX1養(yǎng)殖模式的得分最高，揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)最好，其后依次為DX2、XX2、XX1、DX3、OX。

表5 不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦PCA和綜合得分Table 5 PCA and comprehensive scores of Procambarus clarkii in different culture modes

2.5 聚類分析結(jié)果

分層聚類是聚類過程中常用的方法，期取代聚類樣本中個(gè)體與距離的關(guān)系，并將距離相近的樣本歸入一類，重復(fù)此過程以完成聚類[33]。如圖3所示，6 組克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式分為5 類，DX1、DX2、DX3、XX1養(yǎng)殖模式為一類，XX2和OX養(yǎng)殖模式為一類。DX1養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中酮類物質(zhì)、烴類物質(zhì)含量較高，品質(zhì)最好；DX2養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦品質(zhì)較好，腥味胺類物質(zhì)含量最低；DX3品質(zhì)較差。揮發(fā)性物質(zhì)可分為4 類，酮類單獨(dú)為一類，酮類閾值較低，含量較高與其他揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性較強(qiáng)；酯類與胺類物質(zhì)聚為一類；醇類單獨(dú)為一類；烴類和其他聚為一類，二者閾值較高，但與其他物質(zhì)相關(guān)性較強(qiáng)。聚類分析與PCA結(jié)果較為相似，可以較為準(zhǔn)確體現(xiàn)6 組養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分品質(zhì)差異。

圖3 不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦的揮發(fā)性成分的聚類分析熱圖Fig. 3 Heatmap of cluster analysis of volatile components of Procambarus clarkii from different culture modes

3 結(jié) 論

通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)分析江蘇省興化地區(qū)不同養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦肉中的揮發(fā)性物質(zhì)，共檢出31 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括8 種酮類、3 種酯類、13 種烴類、3 種胺類、2 種醇類、2 種其他，其中揮發(fā)性物質(zhì)含量最多的是DX1（34.69 ng/g）。主要呈味物質(zhì)酮類和酯類的總含量在OX養(yǎng)殖模式中最高（17.85 ng/g），在XX2模式中含量最低（7.36 ng/g）。利用PCA建立綜合評(píng)價(jià)模型，結(jié)果表明，DX1養(yǎng)殖模式揮發(fā)性風(fēng)味成分品質(zhì)最好，OX養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉揮發(fā)性風(fēng)味成分品質(zhì)較差。聚類分析將不同養(yǎng)殖模式分為5 類，揮發(fā)性物質(zhì)分為4 類，與PCA結(jié)果結(jié)合較好地體現(xiàn)了不同養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦肉揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)的差異性。綜上所述，一稻兩蝦養(yǎng)殖模式的克氏原螯蝦揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)最好，藕蝦養(yǎng)殖模式較差。本研究為建立優(yōu)質(zhì)克氏原螯蝦的養(yǎng)殖模式提供一定的基礎(chǔ)；此外，為建立優(yōu)質(zhì)克氏原螯蝦的養(yǎng)殖模式提供更全面的指導(dǎo)，還需要結(jié)合克氏原螯蝦肉的其他品質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行綜合分析。